【生化】Chem. Sci.：通过近红外荧光和光声成像观察NAFLD小鼠肝脏中的过氧化物酶体黏度
非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）是由除酒精和其他明确的损肝因素外导致的，以肝细胞脂质蓄积为主要特征的疾病，会逐渐发展为肝功能衰竭，因此对其进行早期诊断以提高治疗效率显得至关重要。研究表明，NAFLD的发生与脂质代谢密切相关，而过氧化物酶体是肝细胞脂质代谢的主要场所，所以脂质代谢异常可能直接影响过氧化物酶体的黏度。
基于此，山东师范大学的李平教授和唐波教授课题组将丙二腈基团作为分子转子，HLKPLQSKL肽链作为过氧化物酶体的靶向基团，花菁染料作为荧光团，设计并合成了一种新的近红外荧光（NIRF）和光声（PA）成像探针PV-1，并将其用于NAFLD小鼠体内的过氧化物酶体黏度的实时可视化检测。在低黏度环境中，转子围绕花菁染料的共轭结构自由旋转，能量以非辐射方式耗散，不产生荧光；随着黏度的增加，转子的旋转受到限制，能量通过荧光的形式得以耗散（Scheme 1）。相关成果以“In situ visualization of peroxisomal viscosity in the liver of mice with non-alcoholic fatty liver disease bynear-infrared fluorescence and photoacoustic imaging”为题发表在Chemical Science上（DOI: 10.1039/d0sc02922j）。
（来源：Chemical Science）
首先，作者探究了PV-1在不同溶剂中的光物理性质，发现其在不同溶剂中表现出不同的NIR吸收（Fig. 1a），且在甘油中具有最强的荧光信号（Fig. 1b）。
（来源：Chemical Science）
为了进一步评估PV-1的荧光强度与黏度之间的关系，作者通过在甲醇/甘油体系中添加甘油来增加体系的黏度，并记录不同黏度下PV-1的荧光强度。随着甘油比例的增加，PV-1在705 nm处的荧光不断增强（Fig. 2a），且在纯甘油条件下达到最大值（约25倍）。根据Förster-Hoffmann方程（Fig. 2b），PV-1的log I750和log η之间存在良好的线性关系（R2=0.994）。考虑到荧光寿命是研究PV-1荧光图的重要参数，作者测量了PV-1在不同黏度介质中的荧光寿命，发现其荧光寿命与溶剂黏度有着相似的增长趋势，且在2.0-643.0 cp范围内，log τ与log η之间存在极好的线性关系（R2=0.999）（Fig. 2d）。此外，与PV-1在甘油中的强荧光相比，不同溶剂中的荧光可忽略不计，表明PV-1可用于黏度的检测。
（来源：Chemical Science）
为了探究PV-1的PA成像能力，作者测量了一系列甲醇-甘油混合溶剂中的PV-1的PA信号。随着甘油比例的增加，680nm处的PA信号逐渐增加，并通过拟合Förster-Hoffmann方程表明log PA680与log η之间存在良好的线性关系（Fig. 3a）。另外，在不同生理条件下测得的PA强度表明，只有在甘油中，PV-1表现出在680 nm处的PA信号（Fig. 3b）。以上结果均表明PV-1可用于复杂生理环境中的黏度检测。
（来源：Chemical Science）
随后，作者探究了PV-1在HL-7702细胞和SMMC-7721细胞中的过氧化物酶体定位能力，发现在SMMC-7721细胞中，PV-1的红色荧光与过氧化物酶体GFP的绿色荧光几乎重叠，皮尔森共定位系数为0.91（Figure 4）。同样的，在HL-7702细胞中也获得了类似的实验结果。以上结果表明，PV-1可以精确地靶向并定位到活细胞的过氧化物酶体。
（来源：Chemical Science）
研究表明，过量的长链游离脂肪酸会损害过氧化物酶体的β-氧化能力，导致脂质堆积。因此，作者评估了PV-1检测活细胞异常脂质代谢过程中黏度的能力。作者用油酸（OA）刺激细胞产生脂质异常代谢，并用PV-1进行孵育。与对照组相比，OA处理后的细胞的过氧化物酶体显示出明亮的荧光（Fig. 5），表明PV-1可以用于异常脂质代谢过程中过氧化物酶体的黏度检测。除此之外，作者发现病变细胞中也显示出明亮的荧光，但是，荧光信号位于整个细胞质而非过氧化物酶体中（Fig. 5g），因此不影响实验结果。
（来源：Chemical Science）
接着，作者对PV-1是否可以用于区分NAFLD小鼠和正常小鼠进行探究。通过喂食高脂饮食（60 kcal%脂肪）连续6周，作者构建了NAFLD小鼠模型。过量的脂质积累会导致一系列反应并产生过量的ROS，从而引起严重的继发性肝损伤，因此作者用NAC（一种粘液溶解剂）和维生素E（抗氧化剂）减少ROS并减轻NAFLD，用吡格列酮药物治疗NAFLD，再注射PV-1进行NIRF成像。由图可知，正常小鼠的肝脏显示出微弱的荧光，而NAFLD小鼠的肝脏发出明亮的荧光信号（Fig. 6），表明NAFLD小鼠的肝脏具有更高的黏度。除此之外，NAC、维生素E和吡格列酮使NAFLD小鼠肝脏的荧光信号产生不同程度的减弱，表明三者均可以减轻NAFLD。这种过氧化物酶体黏度成像方法不仅可以用于NAFLD的早期诊断，还可以用于筛选治疗NAFLD的药物。
（来源：Chemical Science）
最后，作者通过PA成像技术检测NAFLD小鼠肝脏中的过氧化物酶体黏度。与正常小鼠相比，NAFLD小鼠肝脏的PA信号明显更强（约4.4倍），而吡格列酮、维生素E和NAC则可使PA信号显著降低（Fig. 7），这与体内荧光成像结果基本一致。因此，基于PV-1的PA成像技术可以准确反映过氧化物酶体的黏度变化并指示NAFLD的发生。
（来源：Chemical Science）
总而言之，作者设计并合成了一种新的NIRF和PA双模态成像探针PV-1，具有极好的黏度特异性和选择性，并将其用于NAFLD小鼠体内的过氧化物酶体黏度的实时可视化检测。这为指示NAFLD的发生和发展以及评估药物对NAFLD的疗效提供了帮助。