使用monocle做拟时序分析（单细胞谱系发育）

我们在单细胞天地发布的全网第一个单细胞转录组课程，精炼了常规单细胞转录组数据分析主线，就是5大R包， scater,monocle,Seurat,scran,M3Drop，然后10个步骤：

  • step1: 创建对象

  • step2: 质量控制

  • step3: 表达量的标准化和归一化

  • step4: 去除干扰因素(多个样本整合)

  • step5: 判断重要的基因

  • step6: 多种降维算法

  • step7: 可视化降维结果

  • step8: 多种聚类算法

  • step9: 聚类后找每个细胞亚群的标志基因

  • step10: 继续分类

因为是第一个课程，所以并没有提到单细胞转录组的部分新颖分析要点，比如构建细胞谱系发育，虽然我其实在课程里面也稍微提到过一点，不过怕大家印象不深刻，所以还是有必要单独拿出来讲解一下。

而构建细胞谱系发育，就不得不提Monocle了，值得注意的是有两个版本，我们选择讲解V2，它的官网在：

  • 版本2：https://cole-trapnell-lab.github.io/monocle-release/docs/#installing-monocle

  • 版本3：https://cole-trapnell-lab.github.io/monocle3/monocle3_docs/

构建细胞谱系发育，也就是pseudotime（拟时序分析），主要是判断不同细胞表达量之间的关系，不同亚群之间表达量过渡的变化就是一条轨迹，类比于随着时间的发育过程的基因表达变化，但并不是真正的时间上的变化，因此我们叫它”拟时序“，而不是”真时间分析“。所以多个细胞亚群可以有多个起点，多条轨迹哦。

同样我们首先拿scRNAseq包的表达矩阵测试

这个包内置的是 Pollen et al. 2014 数据集，人类单细胞细胞，分成4类，分别是 pluripotent stem cells 分化而成的 neural progenitor cells (“NPC”) ，还有 “GW16” and “GW21” ，“GW21+3” 这种孕期细胞，理解这些需要一定的生物学背景知识，如果不感兴趣，可以略过。这个R包大小是50.6 MB，下载需要一点点时间，先安装加载它们。

这个数据集很出名，截止2019年1月已经有近400的引用了，后面的人开发R包算法都会在其上面做测试，比如 SinQC 这篇文章就提到：We applied SinQC to a highly heterogeneous scRNA-seq dataset containing 301 cells (mixture of 11 different cell types) (Pollen et al., 2014).

不过本例子只使用了数据集的4种细胞类型而已，因为 scRNAseq 这个R包就提供了这些，完整的数据是 23730 features， 301 samples, 地址为https://hemberg-lab.github.io/scRNA.seq.datasets/human/tissues/ ， 这个网站非常值得推荐，简直是一个宝藏。

这里面的表达矩阵是由 RSEM (Li and Dewey 2011) 软件根据 hg38 RefSeq transcriptome 得到的，总是130个文库，每个细胞测了两次，测序深度不一样。

首先拿到表达矩阵和表型信息

这里仅仅是挑选65个高深度的单细胞文库，代码如下：

library(monocle)
library(scRNAseq)
## ----- Load Example Data -----
data(fluidigm) 
ct <- floor(assays(fluidigm)$rsem_counts)
ct[1:4,1:4] 
sample_ann <- as.data.frame(colData(fluidigm)) 
table(sample_ann$Coverage_Type)
table(sample_ann$Biological_Condition) 
kp=sample_ann$Coverage_Type=='High'
ct=ct[,kp]  
sample_ann=sample_ann[kp,]

然后构建monocle需要的对象

构建Monocle后续分析的所用对象，主要是根据包的说明书，仔细探索其需要的构建对象的必备元素，需要的phenotype data 和 feature data 以及表达矩阵,

注意点: 因为表达矩阵是counts值，所以注意 expressionFamily 参数

gene_ann <- data.frame(
  gene_short_name = row.names(ct), 
  row.names = row.names(ct)
)

pd <- new("AnnotatedDataFrame",
 data=sample_ann)
fd <- new("AnnotatedDataFrame",
 data=gene_ann)

sc_cds <- newCellDataSet(
  ct, 
  phenoData = pd,
  featureData =fd,
  expressionFamily = negbinomial.size(),
  lowerDetectionLimit=1)
sc_cds

下面是monocle对新构建的CellDataSet 对象的标准操作, 注意estimateDispersions这步的时间和电脑配置密切相关，甚至如果电脑内存不够，还会报错！

sc_cds <- estimateSizeFactors(sc_cds)
sc_cds <- estimateDispersions(sc_cds)

轨迹分析需要指定基因

这些基因可以是细胞亚群直接的差异基因集。

if(F){
  disp_table <- dispersionTable(cds)
  unsup_clustering_genes <- subset(disp_table, 
  mean_expression >= 0.1)
  cds <- setOrderingFilter(cds, unsup_clustering_genes$gene_id)
  dim(cds)
  diff_test_res <- differentialGeneTest(cds,
 fullModelFormulaStr = "~Biological_Condition")
  # 哪怕仅仅是65个单细胞，monocle的这个differentialGeneTest函数运行也不快。
  ordering_genes <- row.names (subset(diff_test_res, qval < 0.01))
  save(ordering_genes,file = 'ordering_genes_by_Biological_Condition_high.Rdata')
}
load(file = 'ordering_genes_by_Biological_Condition_high.Rdata')

使用官网代码构建谱系发育

cds <- setOrderingFilter(cds, ordering_genes)
plot_ordering_genes(cds) 
# 然后降维
cds <- reduceDimension(cds, max_components = 2,
  method = 'DDRTree')
# 降维是为了更好的展示数据。
# 降维有很多种方法, 不同方法的最后展示的图都不太一样, 其中“DDRTree”是Monocle2使用的默认方法
# 接着对细胞进行排序
cds <- orderCells(cds)
## 最后两个可视化函数 
plot_cell_trajectory(cds, color_by = "Biological_Condition")  
# 可以很明显看到细胞的发育轨迹 
# 还有几个其它可视化函数，我们明天介绍
plot_cell_trajectory(cds, color_by = "State")
plot_cell_trajectory(cds, color_by = "Pseudotime")
plot_cell_trajectory(cds, color_by = "State") +
  facet_wrap(~State, nrow = 1)

因为NPC细胞跟另外3种细胞从生理上就不一样，所以是单独的发育轨迹，而 “GW16” and “GW21” ，“GW21+3” 这种孕期细胞，就可以很清晰的看到时间被反映在我们的拟时序分析结果了。

选择错误的基因集去做轨迹分析会怎么样呢？

比如我因为嫌弃monocle的这个differentialGeneTest函数运行太慢，为了简单写教程，就直接直接挑选top2000的MAD基因。

# 加入为了方便起见，直接挑选top2000的MAD基因。
ordering_genes=names(tail(sort(apply(cds@assayData$exprs,1,mad)),2000))

使用这2000个基因去跑拟时序分析，得到的单细胞发育谱系如下：

是不是很有趣！
当然了，出这样的图还只是万里长征第一步啦！

下一讲：有了发育轨迹之后呢？

敬请期待！

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