编译：雪花飘飘，编辑：木木夕、江舜尧。
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导读
肠道微生物失调在结直肠癌(CRC)中具有关键作用。然而，瘤内微生物群及其与CRC进展的关系仍然处于未知阶段。因此，作者收集了436例结直肠癌（n=36）或腺瘤（n=32）患者的组织活检（每例患者2-6例肿瘤活检加上2-5例邻近正常组织活检）。通过16S rRNA基因测序进行微生物谱分析，随后对微生物多样性和异质性进行研究。同时分析了所有肿瘤活检标本中微生物失调与宿主基因改变（KRAS突变和微卫星不稳定性（MSI））之间的关系。研究发现肿瘤内的微生物群落具有异质性。一些结直肠癌相关致病菌（梭杆菌、类杆菌、微小单胞菌和普氏杆菌）的丰度在单个肿瘤中高度不同。这种异质性与结直肠癌发展的相关性揭示了微生物群落的改变，包括肿瘤内丰度变化较大的微生物。此外，研究还发现瘤内单个微生物丰度的变异沿着腺瘤-癌序列发生变化。这项研究为肠道微生物异质性对CRC进展的贡献提供了新的见解。
原名：Microbial community heterogeneity within colorectal neoplasia and its correlation with colorectal carcinogenesis
译名：结直肠癌组织中微生物群落异质性及其与结直肠癌发生的关系
期刊：Gastroenterology
IF：17.373
发表时间：2021.02.11
通讯作者：于君
通讯作者单位：香港中文大学
在这项研究中，每名患者抽取2-6份结直肠肿瘤（大肠癌或腺瘤）的组织活检和2-5份相邻正常组织的组织活检。采用16S核糖体RNA（rRNA）基因测序对436例结直肠癌或腺瘤患者的组织活检标本进行微生物群分析。
作者收集了来自两个地理位置不同的医院的21名大肠癌患者和20名腺瘤患者的266份组织活检。从每个人身上取4-6个肿瘤组织活检加上2个相邻正常组织活检。为了获得微生物多样性，进行了16S rRNA基因测序，每个活检产生4.94±1.18（104，平均值±标准差）个读数。作者首先探索了微生物群落的整体表型模式，发现在两个队列中，大肠癌组织的α多样性（Chao1和Shannon指数）低于腺瘤组织（图1A和补充图4B-C）。两组大肠癌和腺瘤组织的β多样性也存在显著差异（P<0.01，PERMANOVA；图1B）。然而，肿瘤和相应的邻近正常组织之间微生物多样性（α和β多样性）的差异并不显著（图1A和B），这与以前的报道一致。而某些个别微生物，包括消化链球菌属和梭杆菌属，在结直肠癌中明显富集于结直肠癌邻近的正常组织。此外，我们确定肿瘤内微生物群落与肿瘤亚型（典型或粘液腺癌；P=0.033，PERMANOVA）和肿瘤位置（左侧或右侧大肠癌；P=0.029，PERMANOVA）在个体水平上显著相关（队列1和队列2的21名大肠癌患者）。然后，作者分析了所有41名患者每次活检中的细菌组成，以获得门水平上的单个微生物群概况（图1C）。大多数结直肠癌患者的梭杆菌丰度（平均5.36%）高于腺瘤患者（平均0.11%）。结直肠癌患者黏膜菌群以厚壁菌门为主（平均35.68%），其次为变形菌门（平均19.53%）。相比之下，腺瘤患者的微生物群以变形菌门为主（平均32.16%），其次为厚壁菌门（平均22.21%）。
图1 微生物群落的总体特征。A、从腺瘤、腺瘤、CRC相邻正常组织和每组的CRC相邻正常组织收集的结肠粘膜活检中α多样性（Chao1统计量）。中间的白色条表示中间值，白色“+”符号表示平均值。α多样性的显著性采用双尾Mann-Whitney U检验。B、从腺瘤、腺瘤、大肠癌的邻近正常组织和大肠癌的邻近正常组织收集的结肠粘膜活检中的β多样性（基于bray距离的NMDS分析）。群落差异性用PERMANOVA分析。NMDS1和NMDS2轴评分均采用双尾Mann-Whitney U检验。C、每个病人8个主要门的细菌分布。每个个体的肿瘤形成（右侧）和相邻的正常（左侧）活检用灰线隔开。结直肠癌患者简称“C”，腺瘤患者简称“P”。*P<0.05；**P<0.01；**P<0.001；****P<0.0001。接下来，作者通过对单个肿瘤不同区域以及相邻正常组织的多个活检来评估结直肠肿瘤内的微生物群落是否具有异质性。根据3个标准（NA≥1，肿瘤相对丰度≥0.1%，CV≥50，详见材料与方法）筛选出具有代表性的属。这些属用于为队列1（n=11）和队列2（n=10）的每个结直肠癌组织（每个组织4-6个活检，共138个活检）创建微生物图谱。值得注意的是，与来自同一结直肠癌患者的其他肿瘤活检结果相比，作者发现每个肿瘤患者活检结果都有属于自己的微生物群组成。这些观察结果在队列1（图2A）和队列2（补充图8A和B）的所有CRC患者中得到证实。观察到肿瘤内微生物群落具有异质性，并通过绘制CRC患者1的图谱（CV>50；图2B和补充图8C）进行了典型化。网络图分析显示微生物在特定的肿瘤内部位富集（图2C）。作者还评估了第1组（n=10）和第2组（n=10）中20例腺瘤患者（共128例活检）的微生物图谱。同样，所有腺瘤患者的瘤样活检中，微生物群组成彼此之间存在显著差异（%CV>50）。
图2 肿瘤内微生物群落的异质性。A、总结了队列1中CRC患者2至11的细菌图谱。左面板显示了每个肿瘤活检组织与其相应的相邻正常组织正常化后的微生物群分布。每个病人肿瘤内微生物之间的网络图分析如右图所示。B、从队列1（C1）的一名代表性大肠癌患者的单个肿瘤中收集的5个活检标本中的异质性微生物群组成。上图显示了肿瘤活检中每种微生物丰度的总体肿瘤内变化。选定的微生物根据它们所属的门上色，右下角有标记。P值表示用Fisher精确检验法测定微生物群落间的差异性。用渐近检验法计算各微生物变异系数的显著性。C、C1患者肿瘤内微生物的网络图分析。红线代表特定于个别部位的微生物。绿线表示微生物在多个地点共享。每个微生物被标记在一个圆圈中，圆圈的大小和颜色分别对应于微生物丰度和钠的变化水平。在每个微生物前面加上前缀：“T1-5”表示定点微生物，“S”表示定点共有微生物。*P<0.01。为了验证肿瘤内微生物异质性与结直肠癌发生之间是否存在相关性，作者选择了丰度变化较大的微生物（CV>50），并将其命名为高变异微生物（HVMs）。总的来说，在两个队列的大肠癌组织中鉴定出156个HVMs，在腺瘤组织中鉴定出203个HVMs（图3A）。发现与大肠癌相比，腺瘤中HVMs的数量更高（P<0.05，双尾Mann-Whitney U检验；图3B），表明瘤内HVMs可能沿着腺瘤-癌序列减少。通过将与肿瘤状态相关的肿瘤内丰度变化相似的微生物分组，建立了五个元群落（图3C）。特别是第1组（称为c1-1）的元群落1由大肠癌中富集的HVMs组成；第1组（c1-2）的元群落2由腺瘤中富集的HVMs组成；而第1组（c1-3）的元群落3由大肠癌和腺瘤中富集的HVMs组成。在富含CRC的元群落c1-1中，半数以上的HVM属于厚壁菌（54.00%；包括细小单胞菌和消化链球菌）；而富含腺瘤的元群落c1-2以变形杆菌为主（43.14%）。将队列1和队列2的HVMs结果进行比较。作者发现HVMs在集合群落c1-1（在大肠癌中富集）和c1-3（在大肠癌和腺瘤中富集）中的分布可以分别在队列2中的集合群落c2-1和c2-3中得到验证（图3C）。元群落c1-1和c2-1之间的HVMs相似性为40%；元群落c1-3和c2-3之间的HVMs相似性为63%（Sørensen Dice系数；图3D）。因此，这些结果表明，微生物群落的改变发生在腺瘤-癌序列。
图3 肿瘤内丰度变异与腺瘤-癌序列。A、结直肠癌患者（上图）和腺瘤患者（下图）两个队列之间存在和共享的HVMs数量。B、在大肠癌（n=21）和腺瘤患者（n=20）中发现的HVMs数量。C、具有5个meta群落的热图，用于将丰度具有相似瘤内变化的微生物分组（meta群落c1-1到c1-5用于第1组；c2-1到c2-5用于第2组）与肿瘤状态（腺瘤和结直肠癌）相关。标记为红色的区域表示HVM，标记为白色的区域表示非HVM。每个HVM的门显示在热图的左侧，并根据底部的标签上色。患者信息在顶部汇总。右侧根据所属的元群落列出了几个有充分记载的CRC相关属（如梭杆菌属、拟杆菌属、细小单胞菌属和普氏菌属）和益生菌属。D、通过Sørensen–Dice系数测量2个队列之间每个元社区的相似性。*P<0.05；双尾Mann-Whitney U检验。鉴于观察到的变化，作者推测在结直肠癌的发生过程中，每种HVM在瘤内的丰度变化可能是不同的。微生物丰度沿腺瘤-癌序列的变化如图4A所示：在大肠癌的特定瘤内区域富集的一些微生物沿腺瘤-癌序列的丰度变化增加。而在腺瘤特定区域富集的其他微生物则表现出沿腺瘤-癌序列丰度变化的减少。为了确定个体HVM与大肠癌进展之间的关系，选择了大肠癌相关元社区的HVM。通过比较大肠癌和腺瘤中各HVM丰度的变化，计算各HVM的FDV。如果FDV>1，这意味着肿瘤内这种HVM丰度的变异从腺瘤上升到癌（称为变异增加HVM），FDV<1的HVMs称为变异减少HVMs。方差增加的HVMs总量（n=19）略高于方差减少的HVMs总量（n=16；图4B）。队列1产生的数据与队列2进行了验证（图4B；补充表5）。几个与结直肠癌相关的属，包括拟杆菌属、微小单胞菌属和梭状芽孢杆菌科，被鉴定为变异增加的HVM，而粪杆菌属、玫瑰杆菌属和链球菌属被鉴定为变异减少的HVMs。总的来说，作者的发现揭示了肿瘤内单个微生物丰度的变化可以沿着腺瘤-癌序列改变。
图4 高度可变微生物(HVMs)在腺瘤-癌序列中的变化。A、HVMs在疾病进展中变异的图解。B、每个HVM在腺瘤-癌序列中的内发育变化。通过比较在CRC肿瘤和腺瘤中各HVM丰度的变化，计算各HVM的FDV。红色代表从队列1获得的FDV，蓝色代表从队列2获得的FDV。有和无MSI（MSI阳性：n=14）的大肠癌组织中的微生物群落显著分离（P<0.001，双尾Mann-Whitney U检验；图5A），38种微生物显示出与MSI的强相关性（AUROC=0.90；图5B）。属于变形杆菌的属占了大多数微生物，包括加利奥尼拉菌（DMA=0.0233）和脱氯单胞菌（DMA=0.0198），它们与MSI呈正相关（图5C2；补充表7）。总的来说，作者发现在有宿主基因改变的组织中存在明显的瘤内微生物群。随后评估了突变谱与异质性肿瘤内微生物群之间是否存在相关性。KRAS突变阳性的大肠癌患者的细菌图谱显示存在不同的肿瘤内微生物群组成（图6A-B，补充图8A和B）。基于MSI阳性肿瘤活检的大肠癌患者的细菌图谱，还确定了异质性肿瘤内微生物群落（图7A-B，补充图8A和B）。就单个微生物而言，26个KRAS相关微生物中的22个（85%）被鉴定为HVMs，38个MSI相关微生物中的28个（74%）被鉴定为HVMs（图5D）。这些发现共同表明，超过70%的突变相关微生物在肿瘤内的丰度有很大的变异。
图5 肿瘤内微生物群落与宿主基因突变的关系。A、大肠癌组织活检中有无KRAS突变（左图）和MSI（右图）的微生物群落被RI分类器显著分离。中央白色条表示中位数RI，中央白色三角形表示平均RI；双尾Mann-Whitney U检验。B、采用10倍交叉验证方法，在KRAS相关属（左图）和MSI相关属（右图）上生成RI分类器的接收器工作特性曲线。虚线和误差线代表交叉验证的10倍模型中的每一轮。用人工筛选的属的RI分类器生成实心黑线，属是突变相关类群的一个子集（丰度的平均差异≥0.5%）。C、与KRAS突变（C1）和MSI（C2）显著相关的微生物。采用零膨胀对数正态模型，FDR<0.05。D、HVMs的数量与KRAS突变（左图）和MSI（右图）显著相关。***P<0.001。
图6 KRAS突变阳性大肠癌患者的细菌定位。CRC患者C3包括1/5的肿瘤活检（T3部位），KRAS突变阳性。A、从C3患者的单个肿瘤收集的5个活检标本中的异质性微生物群组成。左图显示了每种微生物的肿瘤活检中肿瘤内丰度的总体变化。每个肿瘤活检的KRAS突变状态显示在顶面板上，棕色代表突变阳性的活检。选定的微生物根据它们所属的门上色，右下角有标记。用渐近检验法计算各微生物变异系数的显著性。B、C3患者肿瘤内微生物的网络图分析。红线代表特定于各个部位的微生物。绿线表示微生物在多个地点共享。每个微生物被标记在一个圆圈中，圆圈的大小和颜色分别对应于微生物丰度和钠的变化水平。在每个微生物前面加上前缀：“T1-5”表示定点微生物，“S”表示定点共有微生物。*P<0.01。
图7 MSI阳性大肠癌患者的细菌定位。结直肠癌患者C7包括4/5的肿瘤活检（T3部位除外），MSI阳性。A、从C7患者的单个肿瘤收集的5个活检标本中的异质性微生物群组成。每个肿瘤活检的MSI状态显示在顶面板上，棕色代表MSI阳性的活检。选定的微生物根据它们所属的门上色，右下角有标记。B、C7患者肿瘤内微生物的网络图分析。*P<0.01。在这项研究中，对每一个结直肠肿瘤和邻近的正常组织进行多个活检，随后进行微生物群分析。在这里作者首次展示了单个结直肠癌肿瘤或腺瘤内的异质微生物群落。发现微生物的丰度在不同的肿瘤形成部位不同，而在整个肿瘤形成过程中丰度变化较大的被称为HVMs。有趣的是，有充分文献记载的结直肠癌相关分类群，如梭杆菌、类杆菌、微小单胞菌和普氏菌，不断地分布在整个结直肠癌肿瘤中，这与结直肠癌研究的多个队列中它们的丰度持续丰富的事实相一致。研究发现，所有这些属在单个肿瘤中都表现出高度的丰度变异。这种现象可能是因为它们在整个肿瘤组织中的总体丰度很高，这可能掩盖了它们在肿瘤组织内部丰度的巨大差异。而其他一些丰度相对较低但丰度变化较大的微生物，如果活检样本不足，则可忽略不计。例如，作者发现Granulicatella和Selenomonas在肿瘤内的丰度有很大的变化，只有少数研究报道它们是与结直肠癌相关的属。总的来说，作者的研究发现异质性肿瘤内微生物群落可能有助于不同的结果之间的表达。因此，建议在进行微生物群分析时，应从每一个肿瘤组织中收集一次以上的活检，以确保更全面地代表整个微生物群落。考虑到在大肠癌进展过程中肠道失调的发生，作者推测结直肠肿瘤内微生物丰度的变化也可能在结直肠癌发生过程中发生改变。在腺瘤中，HVMs以变形杆菌为主（43.14%），但随着被厚壁菌所取代，其在整个HVMs中的比例逐渐下降，最终占结直肠癌HVMs的54.00%。这些发现与先前关于结直肠癌发生过程中微生物丰度和多样性进行性变化的研究一致，其中蛋白细菌和厚壁菌之间的共排关系在结直肠癌中更为常见，而厚壁菌主要存在于结直肠癌组织中。然后作者发现肿瘤内单个HVMs的丰度变化可能沿着腺瘤-癌序列变化。例如，类杆菌（其中脆弱双歧杆菌可分泌肠毒素以刺激促致癌的炎症级联反应）和微小单胞菌表现出从腺瘤到癌的大量瘤内变异。而一些产生丁酸的类群，包括粪便杆菌和罗氏菌属，在大肠癌的发展过程中表现出丰富的肿瘤变异。这些发现表明肿瘤相关微生物群的组成和功能在大肠癌进展中发生了改变。许多特定的微生物与癌症的发生有关，尤其是具核梭杆菌。这些微生物具有在肿瘤中定植的竞争优势，不仅可以改变肿瘤中的整体微生物特征，而且可以改变转移性病变中的整体微生物特征，因此表明它们的存在和影响并不局限于原发性肿瘤。虽然在本研究中，包括梭杆菌和消化链球菌在内的个别微生物的丰度在肿瘤中富集，但作者发现肿瘤和邻近正常组织中的整体微生物群落没有显著差异。值得注意的是，这些发现与以前的报道一致，这意味着肿瘤发生对微生物群的影响可能不仅局限于肿瘤组织，而且也发生在非癌的邻近正常组织中。然而，一个益生元微生物群落如何促进大肠癌的进展至今仍然是个谜。大多数相关的研究主要集中在单个活检组织中微生物的丰富变化肿瘤。因此，当报告疾病发展过程中微生物结构的整体变化时，感兴趣区域内微生物丰度的变化可能是另一个关键因素。此外，在进行微生物定位时，还可以考虑鸟枪式宏基因组测序和宿主DNA的全面缺失，因为这使得跨域分析具有比16S rRNA基因测序更高的分类学分辨率和基因组覆盖率。最近的研究表明，肠道微生物群与宿主遗传变异的相互作用对肿瘤的发生至关重要，而宿主遗传因素可以影响微生物的组成。因此，作者扩展分析来解释肿瘤内微生物群落和宿主KRAS突变或MSI之间的相关性。一些微生物被鉴定与这些宿主基因突变密切相关。厚壁菌属占大多数成员，与CRC肿瘤（5/9）（如消化链球菌和细小单胞菌）和腺瘤（4/7）（如消化链球菌和梭状芽孢杆菌）的KRAS突变呈正相关。这些发现与最近的一项研究一致，该研究表明，厚壁菌的富集与致癌物处理的小鼠腺瘤-癌序列中KRAS蛋白表达增加有关。基因突变的顺序累积在大肠癌发展中的作用已经确立了几十年。包括KRAS突变和MSI在内的相关突变已被用于CRC亚型的分子分类和常规临床试验，以促进个体化治疗。目前，已知KRAS突变可以改变代谢途径，如糖酵解和氨基酸可用性，以支持肿瘤细胞的生长和存活。作者先前发现KRAS突变的CRC细胞通过其转运体SLC25A22增加了对谷氨酰胺等氨基酸的需求。在营养缺乏的环境中，KRAS突变肿瘤可以将细胞外蛋白转运到肿瘤细胞中，细胞内的蛋白通过大细胞胞饮作用降解为谷氨酰胺、丝氨酸和甘氨酸等氨基酸。另一方面，厚壁菌属与氨基酸代谢有关。例如，厌氧消化链球菌参与甘氨酸和梭菌的发酵，也用于丙氨酸、谷氨酸和赖氨酸的发酵。在本研究中，这些微生物在KRAS阳性腺瘤和结直肠癌中富集，它们可能在肿瘤形成中诱导氨基酸的合成。由于KRAS突变的肿瘤细胞需要大量摄取氨基酸来产生肿瘤块，因此肿瘤内微生物产生的氨基酸增加可能有利于KRAS突变细胞的分解代谢，从而促进结直肠癌的发生和发展。此外，作者发现85%的KRAS相关微生物和74%的MSI相关微生物在肿瘤内表现出高度的丰度变异。迄今为止，微生物群中代谢功能改变与KRAS突变或MSI之间的联系研究很少，而且肠道失调与突变相关微生物的富集或缺失可能影响癌前细胞或肿瘤细胞的代谢。因此，将微生物图谱与代谢组学相结合，有助于揭示与大肠癌发生相关的宿主遗传学中微生物群组成和功能改变的深入机制。综上所述，作者发现单个肿瘤不同部位的微生物丰度不同，从而形成异质性微生物群落，并将这些发现与大肠癌发展的腺瘤-癌序列联系起来。作者进一步证明了肿瘤内微生物异质性与KRAS突变和MSI的CRC相关基因改变之间的关联。这些发现为破译肠道微生物群在大肠癌进展中的作用提供了新的见解。新发现：结直肠肿瘤或癌前腺瘤内的微生物群落是异质性的，这种异质性与腺瘤-癌序列和CRC相关遗传改变(KRAS突变和微卫星不稳定)显著相关。影响：肿瘤内微生物群是异质的，与结直肠癌发生有关。这些发现为肠道微生物群异质性在CRC进展中的贡献提供了新的见解。
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