【生化】JACS：溶剂变色荧光探针在氧化和机械应力下成像脂质
近年来，活细胞中细胞器的特异性靶向成像引起了研究者的极大关注，其主要通过荧光团与生物分子（如肽、脂质或寡糖等）的连接得以实现。对于环境敏感型荧光团（如分子转子、机械敏感和溶剂变色染料），可分别通过检测局部粘度、机械张力和极性以监视细胞器的脂质组织。尼罗红作为一种溶剂变色染料，常被用于脂滴的成像，且具有良好的光稳定性及可进行超分辨成像。因此，以尼罗红为基础探究活细胞中各类细胞器的极性和脂质顺序成为可能。
基于此，法国斯特拉斯堡大学的Andrey S. Klymchenko教授设计并合成了一系列带有化学基团的尼罗红衍生物，用于特异性靶向内质网、线粒体、溶酶体、高尔基体、质膜和脂滴，并探究了各个细胞器中独特的极性/脂质分布。相关成果以“Targeted Solvatochromic Fluorescent Probes for Imaging Lipid Order in Organelles under Oxidative and Mechanical Stress”为题发表在J. Am. Chem. Soc.上（DOI: 10.1021/jacs.0c10972）。
首先，为了获得细胞器特异性溶剂变色探针，作者采用氨基末端偶联策略将尼罗红荧光团与靶向部分缀合（Figure 1A）。作者使用三苯基膦靶向线粒体、N-烷基吗啉基团靶向溶酶体、氯丙基和五氟苯基靶向内质网、肉豆蔻酸靶向高尔基体。所有的探针都是从先前报道的含羧酸的尼罗红衍生物（NR-COOH）开始合成，并获得良好的产率（Figure 1）。
（来源：J. Am. Chem. Soc.）
由于尼罗红部分具有亲脂性，因此探针有望通过其特征发射波长报告特定细胞器生物膜中的局部极性和脂质顺序。此外，探针有望感知脂质过氧化引起的生物膜极性改变而导致的氧化应激，以及与机械应激相关的细胞器膜脂质顺序改变导致的高渗透休克（Figure 1C）。
在不同极性的有机溶剂中，所有新探针均显示出高荧光量子产率和溶剂变色位移，其条带位置与母体尼罗红（Table 1）相似，表明荧光团保留了其光学性质，包括溶剂变色。随后，作者研究了探针在大单层囊泡（LUV）中的光物理性质，这些囊泡呈现Ld相和Lo相。在DOPC LUV中，与缓冲液相比，所有探针均显示出荧光增强和良好的量子产率，并伴有640-650 nm左右的蓝移发射（Table 1和Figure 2）。
（来源：J. Am. Chem. Soc.）
（来源：J. Am. Chem. Soc.）
接着，为了评估探针靶向给定细胞器的能力，作者将其与活KB细胞以及相应的细胞器标记物一起孵育（Figure 3）。结果显示，每个新探针都显示出与相应商业标记物相当的共定位程度。重要的是，探针NRLyso比商业溶酶体标记物表现出更高的溶酶体靶向性（Figure 3E）。
（来源：J. Am. Chem. Soc.）
由于尼罗红的发射带位置描述了脂质结构的局部极性和顺序，作者通过记录并分析低于和高于600 nm的染料发射带的短波和长波部分构建了比例图像。当比较Ld和Lo相时，LUV的比率荧光显微镜显示探针的伪彩色有很大的差异（Figure 4A）。实际上，在Lo相中，绿色/红色荧光强度比在系统上更高，这与通过光谱法观察到的发射光谱中的蓝移相对应（Figure 2）。接着，作者分析了图像中绿色/红色强度比的分布，并进一步获得了平均比值，从而量化了探针对Ld-Lo相变的比率响应幅度（Figure 4C和 Figure 4D）。有了Ld和Lo相的校准数据，作者对活KB细胞进行了比率成像（Figure 4B）。引人注目的是，伪彩色在不同的细胞器中表现出了巨大的变化，这反映出绿色/红色比例的强烈差异，从而反映了局部极性（Figure 4C, D）。的确，在线粒体和内质网中观察到的橙色伪彩色表明了最大极性的微环境，而脂滴和蓝绿色质膜中的蓝紫色点则反映了较低的局部极性（Figure 4B）。随后，作者将细胞中的绿色/红色比率与LUV校准图像中的比率进行了比较，并解释了局部极性的变化（Figure 4C, D）。
（来源：J. Am. Chem. Soc.）
最后，作者研究了氧化应激和机械应激下探针感知极性改变的能力。将细胞暴露于过氧化氢下（H2O2）引起氧化应激，结果发现H2O2处理不会影响新探针的细胞器特异性，但是不同细胞器的伪彩色图像中绿色/红色比例发生了显著变化，如溶酶体和线粒体的绿色/红色比率降低，相对应的是极性最明显的增大（Figure 7）。进一步的，作者使用新探针监测了高渗透压力下局部极性和脂质顺序的变化，结果与氧化应激刺激结果相类似（Figure 8）。
（来源：J. Am. Chem. Soc.）
（来源：J. Am. Chem. Soc.）
总而言之，作者基于尼罗红合成了一系列针对细胞器的溶剂变色荧光探针，其能够选择性地靶向细胞器并感应局部极性，从而揭示其脂质顺序的细微差别。这项工作提出了一种探针工具包，可直接用于细胞生物学、力学生物学和生物物理学，以阐明细胞器的行为及其对外部压力的反应。