COL4A5基因敲除小鼠模型构建

今天我们要讲的主角是Alport综合症致病基因之一COL4A5。

基因基本信息

COL4A5基因研究概况

COL4A5是编码IV型胶原蛋白的六个基因之一，这种蛋白胶原肽是细胞膜的重要基质之一。该基因位于X染色体上，长度超过20万个碱基对，属于相对较大的基因。同时，其外显子超过50个。该基因的突变有可能导致眼-耳-肾综合症，该疾病又被称为Alport综合症。

该疾病是一种遗传性胶原病，由于该基因位于X染色体上，因此遗传与性别有关。3种编码IV型胶原蛋白的基因发生改变都有可能造成该疾病的发生，它们分别是编码α3、α4和α5链的COL4A3、COL4A4和COL4A5。这些蛋白的突变会导致基底膜发生病变，其中肾脏受损最为明显，表现为尿血、蛋白尿和肾功能进行性下降；其次常伴有神经性听力下降和视觉异常，这是由于患者不同气管胶原结构异常所导致。这三种基因共同在人群中有1/10 000～1/5000的致病突变携带率。

图1. Alport综合症，信息来源：https://kidneyfailuretreatment.in/alport-syndrome/.

虽然COL4A3和COL4A4都会引起Aloport综合症，但是，由这两个基因突变引起的Aloport综合症比例只有20%，大部分Alport综合症都是由于COL4A5基因突变造成的。其中，涉及到外显子的突变中有接近一半是错义突变，另外有1/4是移码突变，此外还有少量的无义突变和剪切位点突变，其中无义突变和移码突变引起的病情最重，发病也一般较早。通过对该基因外显子突变与临床信息的关联来看，该基因外显子发生突变会有超过70%的致病概率，如果把一些大概率致病的突变也加入进来，则突变致病的概率为84%。

图2. COL4A5与Alport综合症。信息来源：Clinvar.

2019年，日本实验室构建了最新的Alport疾病模型，用同源重组的方法将含有人类相应突变（R471X）附近的序列通过sgRNA引导，Cas9切割，ssODN（含突变位点）进行修复等一系列的过程构建了无义突变的小鼠。造成该蛋白无法表达。对尿液的检测发现R471X小鼠的蛋白和肌酐水平显著高于正常组；血液中总蛋白没有显著差异，但是血液中的尿氮和尿肌酐出现明显的提升。对6周大的小鼠进行免疫组实验化也发现了R471X小鼠的肾小管纤维化。

图3. COL4A5敲除小鼠的构建。引自：Hashikami et al. 2019。

图4. COL4A5敲除小鼠模型的表型。引自：Hashikami et al. 2019.

第二年，同一个实验室利用反义寡核苷酸（antisense-oligonucleotide, ASO）对上述模型（R471X）进行了治疗，原理是通过阻止21号外显子的翻译，让20号和22号外显子直接相连，跳过无义突变的区域。从小鼠4周龄开始，4-6周每周两次皮下注射，7-20周每周注射一次。结果显示经过ASO治疗的小鼠的生存状态大大好于R471X小鼠，完全达到了野生型的水平。在体重没有明显区别的情况下，其尿蛋白/尿肌酐水平大大降低，同时血液中的各项指标也几乎恢复到了野生型小鼠的水平。

图5. 外显子跳跃示意图。引自：Yamamura et al. 2020.

图6. 经过ASO治疗的小鼠的生存状态大大好于R471X小鼠，完全达到了野生型的水平。引自：Yamamura et al. 2020.

图7. 经过ASO治疗的小鼠和R471X小鼠表型指标。引自：Yamamura et al. 2020.

COL4A5作为X染色体连锁Alport综合症的主要致病基因，一方面需要加强大众对该疾病的认识，有相关症状的父母需要进行诊断及家族病史追踪，确认是否为该疾病的携带者；另一方面也需要基因测序的成本继续降低，才能让更多的人从源头上避免该类疾病的发生；此外，即便确诊了疾病，目前基因治疗技术的发展也让我们不再对Alport综合症完全束手无策，至少看到了值得为之努力的方向。