Science | 将基因编辑与单细胞测序相结合，张锋等人开发新型基因筛检方法
目前，人类基因研究已经揭示了与许多疾病风险相关的基因和基因位点。由于风险基因可能会影响任何细胞类型或组织中的任何细胞过程，这为确定可能的下游效应创造了巨大的探索空间。因此，我们亟需一种新的高通量方法来在体内跨各种细胞类型功能上解析这些基因集合。
已有研究显示，利用家系三人全外显子测序（Trio-WES）可揭示许多从头功能缺失变异（de novo loss-of-function variants），这些突变可引起神经发育异常，如自闭症谱系障碍和神经发育迟缓（ASD/ND）。由于ASD/ND相关突变基因编码的产物在功能上有很大的差异，且很少在动物或细胞模型中进行研究，因此，从头功能缺失变异基因在大脑发育过程中所起的作用尚不了解。
为解决上述挑战，来自Broad研究所的张锋、Aviv Regev、Paola Arlotta等联合团队，基于CRISPR-Cas9和单细胞RNA测序技术开发了一种高通量的基因筛检方法，即体内Perturb-Seq，可在单细胞分辨率下研究体内复杂组织中大量基因的功能。研究团队利用Perturb-Seq分析了35个ASD/ND风险基因对小鼠大脑发育的影响。近日，该研究已发表在顶级期刊Science上，文章题为“In vivo Perturb-Seq reveals neuronal and glial abnormalities associated with autism risk genes”。
文章发表于Science期刊
研究团队从近期发表的WES研究中优先选择了35个ASD/ND候选基因。Bulk RNA-seq和单细胞RNA-seq分析显示，这些ASD/ND风险基因可以在脑组织不同发育阶段及不同细胞类型中表达。需要利用可扩展的方法来检测分析其在一系列细胞类型和发育事件中的基因功能。为此，研究团队开发了体内Perturb-Seq方法。
首先，研究人员利用CRISPR-Cas9技术构建了转基因小鼠品系，通过转染将靶向不同风险基因的gRNAs递送到小鼠子宫发育胚胎的侧脑室，并在小鼠出生后7天进行单细胞RNA-seq以识别受干扰细胞及其风险基因表达谱。免疫组织化学及scRNA-seq分析显示，Perturb-Seq载体在多种类型的神经细胞和神经胶质细胞中均有表达（图1）。
图1. 体内Perturb-Seq技术的scheme图及其表达。
研究团队对18组不同的怀孕小鼠（共163个胚胎）进行了实验，在小鼠出生后7天使用基于液滴的单细胞RNA-seq获得每个细胞的表达谱及其微扰条形码。结果显示，感染细胞中的每个gRNA靶点都有40~70%的移码插入或删除。随后研究人员采用Louvain聚类法将细胞划分为5个细胞群：皮质投射神经元、皮质抑制神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞及小胶质细胞/巨噬细胞（图2），分析发现ASD/ND风险基因干扰对这五种主要细胞类型的存在和比例的影响非常小。
图2. ASD/ND新生风险基因体内Perturb-Seq的细胞类型分析。
该研究通过加权基因相关网络分析法（WGCNA）确定了14个共同变化基因模块，代表在不同类别的皮质细胞中表达的转录程序。研究团队估计了每个风险基因干扰对14个基因模块的影响以及每组干扰细胞中的模块基因表达如何偏离对照细胞表达水平。结果显示，9个ASD/ND基因的干扰对4种细胞类别的5个模块有显著影响，包括皮质投射神经元、皮质抑制神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞（图4）。Perturb-Seq数据表明，Ank2基因干扰看导致NDnf+中间神经元内IN1模块表达增加；Chd8和Gatad2b基因干扰会显著下调少突胶质细胞的ODC1基因模块。以上数据表明，在活体中，PerturSeq具有识别细胞类型特异性分子变化的能力。
图3. 被ASD风险基因干扰改变的4种细胞类型和5个基因模块。
那么小鼠大脑皮层中与干扰相关的基因模块是否与人类生物学和ASD/ND病理学相关？
研究团队对人脑组织进行了单细胞RNA-seq和单核RNA-seq检测分析，发现小鼠大多数基因模块的表达和模块性在人脑组织中都是保守的。与来自ASD患者的单细胞数据相比，受影响的细胞类型和转录组表型均存在重叠（图5）。进一步表明体内Perturb-Seq实验中被识别为受影响的过程与人脑中受到发育调控的生物过程有关。
图4. 来人脑或人脑器官的scRNA-seq数据及每个基因模块内基因表达。
综上所述，研究团队开发了活体Perturb-Seq技术用于大型基因组的系统遗传学研究，并检测分析了小鼠发育大脑中的ASD/ND风险基因。该研究首次将Perturb-Seq技术应用于一个完整的发育中的有机体，显示了通过分析基因功能以更好地理解复杂疾病的潜力。除此之外，该技术还可应用于完整生物体中其他遗传疾病及基因功能的研究，以更有效的方式在动物模型中筛选基因，可从机理上理解这些基因突变是如何导致疾病的。
· END ·