精准医学：新发现！全基因组cfDNA甲基化分析或可用于胰腺癌早期诊断应用
易点评：
作为消化道常见恶性肿瘤之一，胰腺癌在肿瘤领域素有“癌症之王”的称号，据柳叶刀杂志记载，胰腺癌大多一经发现即为中晚期，确诊后的五年生存率约10%，是预后最差的恶性肿瘤之一。因此，迫切需要找到可靠的预测和诊断生物标记物，以用于胰腺癌的早期检测，做到早诊早治，进而延长患者生存期。
近年来，血浆中无细胞循环DNA（cfDNA）甲基化的检测已引起非侵入性和早期癌症诊断的全球关注。本文通过甲基化DNA免疫沉淀结合高通量测序（MeDIP-seq）对胰腺导管腺癌（PDAC）患者进行了全基因组cfDNA甲基化分析研究，最终确定了一组八种差异甲基化标记物，这些标记物可能可用于胰腺癌的非侵入性诊断。
研究背景：
目前，腹部B超、CT/增强CT、磁共振MRI、PET-CT是PDAC最常用的诊断方法。但是，技师的操作方式，患者身体状态如肥胖和肠道气体以及其他因素，诊断医生的经验和阅历都会影响诊断的准确性。此外，与其他消化道肿瘤相比，由于胰腺的特殊位置，要进行早期诊断并不容易。因此，鉴定敏感和特异的非侵入性生物标志物对于PDAC的早期诊断将非常有价值。
近年来，无细胞循环DNA（cfDNA）（称为液体活检）由于其临床优势而引起了医学界的更多关注。作为小双链DNA片段，cfDNA由坏死或凋亡细胞释放并在外周血中循环。在肿瘤发生期间，细胞坏死和细胞凋亡的增加导致cfDNA的积累，可以在相对较早的阶段检测到。此外，cfDNA不仅包含与肿瘤细胞相同的突变，而且具有相同的甲基化模式，从而为早期癌症诊断，甚至对于那些隐藏的器官（如胰腺和胆管）的诊断提供了可能和便利。而甲基化DNA免疫沉淀结合高通量测序（MeDIP-seq）是检测DNA甲基化的灵敏技术，甚至可以检测低至1 ng的初始DNA量。因此最近已经开发出使用MeDIP-seq方法对cfDNA甲基化谱进行全基因组检测，以筛查早期癌症的潜在生物标记。所以，在这项研究中，我们旨在研究在诊断PDAC中潜在的cfDNA甲基化生物标志物。
实验方法：
通过MeDIP-seq分析，将PDAC cfDNA的差异甲基化区域（DMR）与正常对照进行了比较，筛选了143个高甲基化DMRs，它们位于基因启动子并与CGI重叠。再与公开的DNA甲基化数据交叉验证后，其中包括339例胰腺癌（PAAD）和357例正常对照，鉴定出八个标记物，可以用作PDAC患者早期检测，包括TRIM73，FAM150A，EPB41L3，SIX3，MIR663，MAPT，LOC100128977和LOC100130148。
实验结果：
①PDAC患者和健康人之间存在表观遗传学差异
为了分析PDAC患者和健康对照之间的全基因组甲基化模式，作者进行了主成分分析（PCA），以调查两组的全基因组甲基化谱。PDAC患者的甲基化模式与健康对照组相比有显着差异（图1A）。无监督类分析结果进一步表明，PDAC患者和健康对照之间的甲基化模式发生了巨大变化（图1B）。这表明PDAC患者和健康人之间存在表观遗传学差异。
图1
②特定启动子区域发生的特定高甲基化可能导致癌症.
作者专注于启动子区域，识别了 775 个不同的DMR（p＜0.0001），包括来自532个基因的 761 个高甲基化区域 （98.2%）和来自14个基因的14个低甲基化区域（1.8%）（图2B）这些数据表明，在胰腺癌样本中，大多数启动子区域都是高甲基化的，这与先前的发现一致，即特定启动子区域发生的特定高甲基化可能导致癌症
图2
③PDAC患者的CGI中DMR主要为高甲基化
作者在PDAC患者的整个基因组的CGI中共鉴定出761个DMR（p＜0.0001）。其中包括来自507个基因的734个（96.5％）高甲基化区域和来自26个基因的27个（3.5％）的低甲基化区域。映射到整个基因组的CGI中高甲基化和低甲基化的可视DMR信号如（图3）B所示。如（图3C）所示，CGI中高甲基化和低甲基化区域的分布特征被进一步分类。除了3'UTR区域（图3C），在CGI中DMR主要为高甲基化。
图3
④胰腺癌患者CGIs启动子中有143个候选DMRs
作者进一步筛选了位于CGIs启动子中的DMR，共有143个位于与CGIs完全重叠的启动子区域的高甲基化DMRs被确定为候选DMRs。（图4A）这143个候选DMR来自70个基因。
图4
⑤8个标记物能够区分PAAD患者和正常对照。
作者每次都随机选择75%的HM450K数据集来进行循环建模。最终，8个探针被确定为标记的最终选择，在模型中总共500次重复中，需要出现超过450次（表1）。该模型可以将训练数据集(ROC曲线下的区域，AUC=0.975)和验证数据集(AUC=0.943)中的PAAD患者与正常对照组区分开来（图5B）。结果表明，这8个标记物能够区分PAAD患者和具有高敏感性和特异性的正常对照组。
表1
图5
⑥8个标记物可作为胰腺癌早期诊断的潜在生物标记物
作者评估了 696 例病例中 8 个标记物的甲基化水平，包括 339 例 PAAD 患者和 357 例正常对照组。对于所有八个标记，PAAD 患者与正常控制（BH 调整后的p＜ 0.0001）（图 6）之间的整体甲基化水平存在显著差异。因此8个标记物：MAPT，SIX3，MIR663，EPB41L3，FAM150A，TRIM73，LOC100128977和LOC100130148可以作为胰腺癌早期诊断的潜在生物标志物。
图6
结论：
通过MeDIP-seq技术对全基因组cfDNA甲基化进行分析，发现了8种潜在用于胰腺癌早期诊断的生物标记物，可用于早期胰腺癌的非侵入性诊断，这有望成为临床胰腺癌早期诊断的有效方法。
8种胰腺癌生物标记物分别为：MAPT、SIX3、MIR663、EPB41L3、FAM150A、TRIM73、LOC100128977和LOC100130148。
参考文献：
doi.org/10.3389/fgene.2020.596078
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