基因敲入鼠的鉴定、繁殖与应用介绍

1. 基因敲入的鉴定

胚胎移植后的小鼠约在19天后出生，取子代小鼠的基因组DNA进行基因型鉴定，一般使用PCR的方法，通过引物扩增外源片段。

引物设计：一般设计ROSA26位点上下游的引物进行PCR；若要精细地确定插入位置，则需设计三对引物：插入的同源臂前段、插入的同源臂后段、目的片段，用于检测插入片段前端、后端、以及目的基因序列正确与否。若需要更精确的检测，可以进行小鼠基因组测序。

图3.  ROSA26 位点PCR结果示意图

2. 小鼠交配方案设计

与KO鼠相似的，通过对出生的小鼠进行鉴定，一般可以获得F0代基因突变鼠。待F0代小鼠性成熟后将其与具有相同突变类型的小鼠进行交配，可获得具有稳定突变的F1代纯合小鼠。运用下图所示交配方案获得纯合子基因敲入鼠后，令鉴定为纯合子的敲入鼠与另一批敲入纯合鼠交配，获得稳定遗传的后代。

图4.  杂合子小鼠通过基因分离获得纯合子小鼠的交配方案

3. 小鼠使用方案设计

与基因敲除鼠类似，后续小鼠实验分组一般分为实验组（基因敲入鼠）与对照组（野生型），小鼠只数为4~6只。例如，发表于2014年的一项研究中，研究人员就使用了4~6只的小鼠用于分子检测，使用了24组数据用于批量数据比对。[1]

4. 基因敲入小鼠的后续应用

基因敲入鼠可应用于多种研究中，包括且不限于以下几种：

①  多用于构建人源化动物疾病模型；过表达人源基因，模拟人源基因过表达疾病，比如对阿兹海默症的研究就依赖于对APP小鼠（例如，Tg2576-APPswe mice）的运用；[2]

②构建细胞特异表达的Cre鼠，利用启动子的表达特异性，将Cre基因插入启动子之后即可得到特异表达的Cre鼠。例如GFAP-Cre鼠，即是在GFAP启动子后插入Cre基因，在星形胶质细胞表达Cre基因；

③研究外源基因的功能，基因敲入可以用于研究非鼠源的（比如人源）基因的功能；

④研究点突变对基因功能的影响；

⑤引入报告基因，如GFP，观察启动子的表达情况。