科研 | 南京大学：低浓度的银纳米粒子和银离子干扰了固氮蓝藻的抗氧化防御系统和氮代谢（国人佳作）
编译：Y.too，编辑：Tracy、江舜尧。
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尽管纳米银粒子(AgNPs)对水生生物的毒性作用已被广泛报道，但在环境相关浓度下，固氮蓝藻对AgNPs/Ag+的反应在很大程度上尚不清楚。在本篇文章中，我们将蓝藻暴露于不同浓度的AgNPs(0.01, 0.1，和1 mg/L)或Ag+(0.1, 1，和10μg/L) 96小时，研究了AgNPs和Ag+对蓝藻光合作用和固氮的影响，此外，我们利用基于气相色谱质谱(GC-MS)的代谢组学(metabolomics)对AgNP/Ag+暴露下的细胞生理状态进行瞬时快照。高剂量AgNPs (1 mg/L)或Ag+(10μg/L)暴露会导致生长抑制、活性氧过剩、丙二醛积累和N2固定降低，而低剂量AgNPs(0.01和0.1 mg/L)和Ag+(0.1和1μg/L)均未引起明显的反应，然而，代谢组学揭示即使在低浓度的AgNP和Ag+暴露下代谢重编程也会发生。许多抗氧化防御相关代谢物的水平，特别是酚酸和多酚(没食子酸、白藜芦醇、异绿原酸、绿原酸、肉桂酸、3-羟基苯甲酸、表儿茶素、儿茶素和阿魏酸)对AgNPs或Ag+的反应显著降低，说明AgNPs和Ag+即使在低剂量暴露下也能破坏机体抗氧化防御系统，干扰氮代谢。代谢组学被证明是强有力的工具来检测那些无法通过常用手段观察得到的“看不见的”变化。
论文ID
实验设计
1. 通过扫描电镜和元素分析(EDS)确定Nostoc蓝藻细胞形态及AgNPs的定位；
2. 采用不同浓度的AgNPs和Ag+照射后，对蓝藻光合作用和固氮的影响；
3. 利用基于气相色谱质谱的代谢组学分析AgNP/Ag+暴露下Nostoc蓝藻细胞的生理状态和代谢响应；
4. 采用偏最小二乘判别分析(PLS-DA)得分图筛选出对照组和AgNP/Ag+暴露组之间浓度不同的代谢物；
5. 采用代谢通路分析AgNPs和Ag+作用后，对蓝藻代谢生物通路的影响。
实验结果
1. Nostoc蓝藻细胞形态及AgNPs的定位
NPs与水生微生物的吸附和直接接触是产生毒性的先决条件，扫描电镜成像提供了AgNPs和蓝藻之间相互作用的视觉识别，如图所示，蓝藻细胞呈珠状排列(图1)。典型的单细胞长度为3.26μm，宽度为2.05μm(图1A)，在暴露于不同浓度AgNPs的蓝藻表面我们可以看到纳米颗粒的存在(图1B D)。SEM-EDS元素映射证明，粒子由Ag组成，值得注意的是，0.01和0.1 mg/L的AgNP暴露没有引起蓝藻细胞的形状、完整性和形态的改变(图1B,C)，而1 mg/L的AgNP暴露在相当程度上破坏了蓝藻细胞的完整性(图1D)。NPs在水生生物表面的吸附受多种因素的影响，如NPs的理化性质和生物基质(如细胞类型、细胞膜、细胞加工途径等)。NPs在细胞上的吸附力包括范德华力、疏水力、静电引力和特定的化学相互作用，带正电荷的AgNPs (+3.8 mV)很可能通过静电吸引吸附在蓝藻细胞表面。有报道称，藻类细胞上的紧密颗粒附着可导致NP内化，此外，AgNPs释放的银离子可能被蓝藻细胞吸收。通过元素分析(EDS)的TEM图像进一步表明，蓝藻细胞中存在银；然而，这种技术提供的信息相当有限，我们还需要更多的实验来澄清细胞内的银来自银离子或银蛋白。
图1 蓝藻暴露于不同浓度AgNPs
(A)对照，(B) 0.01 mg/L， (C) 0.01 mg/L， (D) 1 mg/L AgNPs)的SEM图像和Ag(红色)的SEM- EDS元素映射。用AgNPs培养蓝藻，在25℃，36μmol光子m-2 s-1的光强下培养96小时。
2. AgNPs和Ag+对蓝藻生长的影响
在不同浓度的AgNPs和Ag+照射96 h后，我们通过测定680 nm光密度(OD 680)来评价蓝藻生物量。结果表明，低、中浓度AgNPs(0.01和0.1 mg/L)和Ag+(0.1和1μg/L)处理下，球孢白僵菌生物量没有变化(图2A,B)。而高浓度AgNPs和Ag+显著降低了蓝藻生物量(p < 0.05)，分别比对照降低了25.8和10.7%(图2A,B)。同样，低、中浓度AgNPs和Ag+处理的叶绿素含量没有变化，而高浓度AgNPs和Ag+处理的叶绿素含量分别比对照显著降低了32.3和18.3%(p < 0.01)(图2C,D)。此外，蓝藻暴露在高浓度AgNPs或Ag+下可以观察到明显的变色(见图2E,F中蓝藻的照片)，这些数据表明，高剂量AgNPs和Ag+部分抑制了蓝藻的生长和光合作用。这些结果并不令人惊讶，也与之前的研究一致。AgNPs释放的Ag+会导致氧自由基的形成，从而引起氧化应激，导致蓝藻生长受到抑制。值得注意的是，AgNPs是原始的，没有表面稳定基团，因此，周正电荷可能导致低静电稳定性和NP团聚，而较低的表面积可能会导致较慢的离子溶解，并可能显著影响生物学结果。
图2 蓝藻生物量在680 nm光密度反射
蓝藻暴露于(A) AgNPs和(B) Ag+。(C) AgNPs和(D) Ag+处理后蓝藻的叶绿素含量。肉眼比较的蓝藻暴露于不同浓度的(E) AgNPs和(F) Ag+。用AgNPs培养蓝藻细胞，在25℃，36μmol光子m-2 s-1的光强下培养96小时。AgNPs: 0, 0.01,0.1，和1 mg/L;Ag+: 0、0.1、1、10μg/L。误差条代表标准差(n = 4)。小写字母表示处理之间的显著差异。
3. 固氮蓝藻
由于光合作用是三磷酸腺苷驱动固氮的主要能量来源，我们评估了AgNPs或Ag+是否会影响固氮活性，由C2H4产量反映的固氮酶活性如图3A、B所示。低、中浓度AgNPs和Ag+处理下的固氮活性均未发生变化，高浓度AgNPs(94.0%)和Ag+(31.0%)处理下的固氮活性显著降低(p < 0.05)，杂孢被认为是固氮酶的固氮位点。与营养细胞相比，杂囊细胞具有较厚的细胞壁修饰细胞，有助于保护酶固氮酶免受氧攻击，N2固定活性的降低可能是由于异囊细胞细胞膜的直接破坏或营养细胞光合作用的间接影响。为了验证AgNPs和Ag+是否降低了N2固定，我们在暴露96 h后测定蓝藻的总氮含量，高浓度AgNPs和Ag+显著降低了Nostoc的总N含量，分别降低了23.5和6.2%(p< 0.05) (图3C,D)，这与固氮活性研究结果一致。
图3 (A) AgNPs和(B) Ag+处理的蓝藻固氮酶活性。(C) AgNPs和(D) Ag+处理后蓝藻的总氮含量。用AgNPs培养蓝藻细胞，在25℃，36μmol光子m2 s 1的光强下培养96小时。AgNPs: 0, 0.01, 0.1，和1 mg/L;Ag+: 0、0.1、1、10μg/L。误差条代表标准差(n = 4)。小写字母表示处理之间的显著差异。
4. 抗氧化系统
人们已经认识到，AgNPs触发ROS的过量产生，进而导致细胞毒性。在不同浓度的AgNPs或Ag+暴露的蓝藻细胞中，我们在24、48、72和96小时测定ROS的产生，结果显示，与对照组相比，高剂量AgNP和Ag+暴露显著增加了Nostoc细胞中的ROS水平(p < 0.05)，早在24小时，并持续到96小时(图4A)，此外，在每个时间点，与Ag+相比，AgNPs诱导了更明显的ROS过剩。这些发现与之前的一篇报道一致，AgNPs和Ag+诱导了藻类细胞(Chattonellamarina)中ROS的过量产生，He等人还将AgNPs的毒性归因于活性氧的过度产生。
脂质膜是最容易受到氧化应激影响的细胞成分之一，脂质过氧化的副产物MDA被用来评估过度产生的ROS是否破坏细胞膜。结果表明，低、中浓度的AgNPs和Ag+没有改变Nostoc中MDA含量(图4B、C)，然而，在暴露于高剂量AgNPs(图4B)和Ag+(图4C)后，MDA含量显著增加，这表明该膜是ROS诱导的AgNPs攻击的靶标；同时，增加的ROS和MDA可以解释暴露于高剂量的AgNPs或Ag+后的生长抑制作用。
图4 (A)暴露AgNPs或Ag+ 24、48、72和96 h后蓝藻细胞内ROS水平。(B) AgNPs和(C) Ag+处理后蓝藻细胞内MDA含量。用AgNPs培养蓝藻细胞，在25℃，36μmol光子m-2 s-1的光强下培养96小时。AgNPs: 0, 0.01,0.1，和1 mg/L;Ag+: 0、0.1、1、10μg/L。误差条代表标准差(n = 4)。小写字母表示处理之间的显著差异。
5. 细胞代谢组学对AgNPs和Ag+的响应
以上表型和生化指标表明，只有较高剂量的AgNPs (1 mg/L)或Ag+(10μg/L)才会导致96 h内的生长抑制和固氮降低。通过非靶向GC ms的代谢组学，我们试图通过鉴定和定量代谢物水平的变化来确定代谢组学是否可以揭示暴露于低浓度AgNPs或Ag+的蓝藻细胞中一些不可见的变化。共鉴定和半定量193个代谢产物。我们进行了多变量分析PLS-DA，以获得代谢产物变化情况的全局视图。PLS-DA模型的得分图显示，AgNPs组通常沿着PC1以剂量依赖的方式与对照组分离(图5A)。同样地，所有的Ag+组都以剂量依赖的方式与对照组明显分开(图5B)，如评分图所示。这些数据表明，即使是低浓度和中浓度的AgNPs(0.01和0.1 mg/L)和Ag+(0.1和1μg/L)也能诱导蓝藻中间产物的整体代谢重编程;换句话说，即使是低浓度的AgNPs和Ag+也会破坏蓝藻的正常代谢，尽管在表型和生化水平上没有观察到响应。
为了筛选出对照组和AgNP/Ag+暴露组之间浓度不同的代谢物，我们进行了单因素分析(方差分析和t检验)。研究发现，在AgNPs和Ag+暴露后，有48和102个代谢物的水平分别发生了显著变化(p < 0.05)(见图5C中的Venn图)，39个代谢物存在重叠(图5C和表S2)。值得注意的是，大部分重叠代谢物都参与了ROS的猝灭和抗氧化防御，例如，一些酚酸和多酚，包括没食子酸，白藜芦醇，异绿原酸，绿原酸，肉桂酸，对苯二酚，3-羟基苯甲酸，1,2,3-三羟基苯，奎宁酸，表儿茶素，儿茶素，阿魏酸和 1,3,5-苯三酚与AgNPs和Ag+呈剂量依赖性降低(参见图6中的方框图)。这些酚酸是蓝藻通过莽草酸产生的，主要通过莽草酯苯丙素生物合成，有趣的是，两种芳香族氨基酸(L-酪氨酸和苯丙氨酸)是莽草酸苯丙烷途径酚类生物合成的前体，暴露于AgNPs后以剂量依赖的方式增加(图S3)。酚酸的生产不足和上游前体的过度积累表明过量产生的ROS对蓝藻细胞的抗氧化系统和防御相关的生物途径产生了不利影响。除了酚酸或酚类物质外，我们还观察到与抗氧化防御相关的代谢物水平发生了更显著的变化，例如，与对照组相比，AgNPs和Ag+以剂量依赖的方式导致草酸显著减少(42-64%)。已有研究表明，草酸能够抑制H2O2的产生，从而调节植物的氧化爆发，草酸的下调可能表明蓝藻细胞响应AgNPs的应激防御机制。脱氢抗坏血酸(DHA)是抗坏血酸(维生素C)的一种氧化形式，在AgNP和Ag+暴露下以剂量依赖的方式降低(图S5)。DHA是一种重要的抗氧化剂相关途径(抗坏血酸和阿尔达酸代谢)的产物，在氧化应激中起着保护细胞的作用。这些抗氧化代谢物的消耗可能淬灭了Ag+诱导的ROS的过量产生，并防止了对重要细胞成分的损害。如此多的抗氧化相关化合物的下调表明，即使在低剂量暴露，抗氧化防御系统也被AgNPs和Ag+激活。我们测定了蓝藻细胞的总抗氧化能力(TAC)，发现高浓度AgNPs(1 mg/L)和Ag+(10μg/ L)分别使TAC显著降低了15.8和10.6%(p < 0.05)(图S6A,B)。
综上所述，即使是低浓度的AgNPs和Ag+也会损害或破坏蓝藻的抗氧化防御系统，其水平低于测定ROS和MDA含量所反映的水平。这表明，众所周知的脂质过氧化生物标志物MDA并不一定提供抗氧化系统已被破坏的早期和敏感的预警。尽管低、中浓度的AgNPs和Ag+在96小时内没有诱导生长抑制，但由于ROS生成和中和之间的平衡被打破，长期暴露后蓝藻的生长和发育将受到损害，甚至导致死亡。
图5 偏最小二乘判别分析(PLS-DA)得分图的蓝藻代谢剖面处理(A) AgNPs和(B) Ag+。(C) AgNPs和Ag+处理后蓝藻代谢产物显著变化的Venn图。AgNPs: 0, 0.01, 0.1，和1 mg/L;Ag+: 0、0.1、1、10μg/L。
6. 通过AgNPs和Ag+改变脂肪酸
一个值得注意的变化是，一些饱和脂肪酸(棕榈酸、棕榈酸和木质素酸)在暴露于低和中浓度的AgNPs和Ag+后增加，但在高剂量下降(图S7)。饱和脂肪酸的上调可能表明蓝藻通过改变质细胞膜的组成和细胞膜的通透性来保护细胞免受ROS攻击。当高浓度AgNP/Ag+暴露下ROS过度产生时，细胞膜受损，这些脂肪酸水平下降。
7. Ag+特异性代谢变化
上述讨论揭示了AgNPs和Ag+常见的代谢变化，如抗氧化化合物的减少，含氮化合物的增加，不饱和脂肪酸的扰动。代谢重编程模式的相似性表明，AgNPs在蓝藻中诱导的部分反应是由于溶解的银离子，然而，不能忽视的是，Ag+诱导的代谢反应比AgNPs强得多。从图S8中可以看出，与AgNPs相比，Ag+降低了额外的抗氧化相关代谢物(壬酸、原儿茶酸、α-生育酚和1,2,4-苯三醇)的水平(图6)。此外，与AgNP暴露不同的是，随着AgNP暴露浓度的增加，抗氧化剂逐渐减少(见图6框图)，Ag+即使在最低剂量下也会导致抗氧化剂水平显著下降；此外，在AgNP暴露下，谷胱甘肽(GSH)没有变化，但对Ag+的反应显著增加(图S9)。GSH不仅作为一种信号分子，而且通过清除自由基来保护大分子免受攻击，自由基是氧化应激的结果，谷胱甘肽可能是与酚类物质相比的第二道抗氧化防线。这说明Ag+对机体抗氧化防御系统的负作用更为明显。Taylor等人还发现，与AgNPs相比，离子银对毒性应激终点有更多的负面影响，这可能反映了AgNPs中Ag+的缓释动力学，而AgNO3中的Ag+几乎可以立即获得。
此外，Ag+处理增加了一些代谢产物的水平，这些代谢产物在AgNPs暴露时是不变的，如乙胺、烟酸、肌醇-4-单磷酸、尿素、苹果酸、丝氨酸、甘氨酸、去缬氨酸、胸腺嘧啶、赖氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、苏氨酸、核糖、d -果糖-6-磷酸和葡萄糖-6-磷酸，这再次表明，与AgNPs相比，Ag+诱导了更强的氧化应激反应和更明显的代谢重编程。这些化合物的上调是蓝藻用来应对被破坏的ROS稳态的策略。在图S10中，6种氨基酸(甘氨酸、丝氨酸、L-苏氨酸、L-天冬氨酸、L-谷氨酸和胸腺嘧啶)、一种有机酸(苹果酸)和两种糖(d -果糖-6-磷酸和葡萄糖-6-磷酸)在Ag+处理下具有非常相似的代谢变化模式。这些代谢物的水平以剂量依赖的方式增加，从控制剂量到低和中剂量，然后不是增加或甚至下降高浓度的Ag+暴露。我们推测蓝藻细胞在Ag+达到阈值之前积极地重新编程代谢组来应对压力，这些碳水化合物和氨基酸的变化表明碳和氮代谢受到干扰。
代谢通路分析表明，AgNPs在低浓度(0.01 mg/L)时没有诱导任何通路扰动，而最低剂量(0.1μg/L)的Ag+可诱导9条生物通路扰动，包括β-丙氨酸代谢;乙醛酸和二羧酸代谢；精氨酸生物合成；半胱氨酸和蛋氨酸代谢；泛酸酯和辅酶A的生物合成；甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢；精氨酸和脯氨酸代谢；异喹啉生物碱生物合成；和酪氨酸代谢。中浓度和高浓度的Ag+分别诱导了14条和21条生物通路的扰动，而中浓度和高浓度AgNPs分别只诱导了10和12条代谢通路的扰动，因此，通路分析证实，与AgNPs相比，Ag+诱导了更明显的代谢变化。氮分析表明，AgNPs和Ag+干扰的大部分通路与氮代谢有关。蓝藻细胞中的碳代谢与不完全三羧酸循环有关；许多碳相关代谢途径受到干扰，如乙醛酸和二羧酸代谢以及淀粉和蔗糖代谢。综上所述，虽然低浓度的AgNPs和Ag+不影响N2固定，但碳和氮代谢受到了干扰。
图6 暴露于不同剂量的AgNPs和Ag +（n = 4）的蓝细菌中抗氧化剂代谢物的相对丰富度的箱形图
（A-D）0、0.01、0.1和1 mg / L AgNPs。（E-G）分别为0.1、1和10μg/ L Ag +。箱形图中相对丰度的标度以对数值给出。
8. 环境影响
在本研究中，我们系统地研究了AgNPs对短期暴露(96 h)中固氮蓝藻的影响；这些蓝藻是许多生态系统的重要组成部分。除了考虑典型的表型和生化终点(OD 680、叶绿素、ROS和MDA)来评估AgNPs对蓝藻的影响，我们还通过基于GC−MS的代谢组学评估了Nostoc蓝藻对AgNPs和Ag+的代谢响应。
而只有高剂量AgNPs和Ag+诱导的生理反应(生长抑制、ROS生产过剩、MDA增加和N2固定降低)，表明ROS稳态失衡和氧化应激，代谢组学研究表明，即使低剂量AgNPs和Ag+也可诱导球状拟南蕨代谢产物谱的改变。许多与抗氧化剂相关的代谢物，特别是酚类物质，在暴露于AgNPs或Ag+时显著下降，即使是低剂量，这表明抗氧化防御系统受到干扰。由于蓝藻在生态系统的C、N循环中起着重要作用，AgNPs和Ag+干扰的抗氧化系统和氮代谢将间接影响水生或陆地生态系统的C、N循环。本研究评价的最低Ag+浓度(0.1μg/L)在观测到的环境浓度(0.04-0.2μg/L)范围内，我们证明，即使在如此低的剂量下，Ag+也可以扰乱蓝藻的代谢，破坏抗氧化防御系统。小分子受上游基因表达和转录本形成的显著调控；因此，即使在低剂量Ag+的情况下，基因表达也一定发生了变化。代谢组学可以用来检测这些无形的变化，并且可以捕捉到常用手段无法检测到的生理变化。
结论
本研究利用基于气相色谱质谱(GC MS)的代谢组学对AgNP/Ag+暴露下的细胞生理状态进行瞬时快照。高剂量AgNPs (1 mg/L)或Ag+(10μg/L)暴露会导致生长抑制、活性氧过剩、丙二醛积累和N2固定降低，而低剂量AgNPs(0.01和0.1 mg/L)和Ag+(0.1和1μg/L)均未引起明显的反应。