科研 | Biomaterials: 基质逆转永生化介导的干细胞命运决定（国人佳作）
编译：微科盟sunshine，编辑：微科盟Tracy、江舜尧。
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体外原代细胞培养会导致细胞衰老，而在本研究中我们发现SV40LT转导的IPFSCs增殖增加，成脂能力增强，但成软骨能力下降。在第5代IPFSCs培养的DECM上扩增出的IPFSCs增殖能力和向软骨细胞分化的能力显著增强，但当IPFSCs生长在第15代IPFSCs培养的DECM上时，这种增强能力减弱。当对SV40LT转导的IPFSCs沉积的dECM进行扩增后，IPFSCs的增殖和成软骨能力增强，但成脂能力降低，尤其是SV40LT转导的第15代细胞来源dECM组。免疫荧光染色和蛋白质组学数据确定了基质成分，如基底膜蛋白是基质介导的IPFSC再生的首选候选成分，在此过程中，RNA-seq检测的转录本证实了细胞的增殖和分化。本研究为深入研究基质蛋白对周围干细胞分化的影响提供了一个有前景的模型。
论文ID
实验设计
实验结果
为建立人IPFSCs(脂肪干细胞)永生化细胞系，我们以GFP (绿色荧光蛋白)为对照，用SV40LT（猿猴病毒40大T抗原）慢病毒载体进行转导。RT-PCR（聚合酶链式反应）数据证实Cas9-SV40LT在IPFSCs中成功转导，SV40组在第5代和第15代细胞中都有SV40LT的强表达，随后在GFP组中表达弱，在CTR(SV40LT转导第1代IPFSC，空白对照组)组中表达可忽略(图1A)。为了确定SV40LT转导是否影响IPFSCs的增殖能力，PDN（最终群体倍增数）结果显示，与CTR和GFP组相似的细胞生长速度相比，SV40LT转导到第15代时细胞生长更快(图1B)，而细胞周期数据显示，SV40组的第5代(图1C)、第10代和第15代的“S+G2”期细胞分别比相应的GFP组增加10倍、9倍和2倍，这也得到了第5代(图1D)、第10代和第15代的相对EDU掺入数据的百分比和中值荧光强度(中值)的证实；另外，使用RNAseq数据的GSEA（基因富集分析）进一步证实，与GFP对照组相比，SV40组细胞周期基因普遍上调(图1E)。为了进一步研究SV40LT转导后的分子表型变化，我们采用流式细胞术对扩增细胞中典型的MSC(间充质干细胞)表面标志的百分率和中位数进行了定量。在SV40LT转导后发现，在所有第5代(图1F)、第10代和第15代IPFSCs中，CD73、CD90和CD105的表达中位数下降，只有CD105的表达略有下降；有趣的是，与CD146表达的百分比和中位数(图1F)相比，SSEA4在第5代的表达中值下降；细胞形态学观察显示，CTR组和GFP组细胞呈梭形，SV40组细胞体积较小。QPCR结果表明，SV40LT转导IPFSCs后，BMI1、KLF4、Pou5f1、NOV、NANOG、SOX2、MYC和NES等基因在IPFSCs中均上调(图1G)，其中BMI1、KLF4、Pou5f1、NOV、NANOG、SOX2、MYC和NES基因均表达上调。对于衰老相关基因，TP53和CDKN2A上调，而CDKN1A下调(图1H)。鉴于SV40是一种致癌的DNA病毒，我们对SV40LT转导后的染色体异常进行了核型分析。结果表明，与CTR组和GFP组的二倍体细胞相比，SV40组的IPFSCs出现了约5%的二倍体和异常核型。
GSEA和RNA-seq数据显示，与GFP对照组相比，SV40组与软骨细胞发育和分化相关的基因下调(图2A)。体外诱导实验证实了这一结果，将CTR、GFP和SV40组的IPFSCs在培养系统中进行了长达14天的软骨诱导，然后用qPCR检测成软骨标志物基因的表达，用阿尔辛蓝染色(Ab)检测硫酸化GAG(硫酸化糖胺聚糖)，用 IHC (免疫组织化学)染色检测II型胶原。与GSEA一致，qPCR数据显示所有被测试的软骨形成基因(SOX9、COL2A1、Acan和PRG4)都显示出类似的趋势——在SV40LT转导后随着时间的推移急剧下降；而COL10A1，一个肥大标记基因，在第5代(图2B)、第10代和第15代细胞(图2D)的IPFSCs中显著增加。染色数据进一步证实，SV40组P5(图2C)和P15细胞(图2E)的颗粒对硫酸化GAG和II型胶原的染色强度低于GFP组，GSEA和RNAseq数据也显示SV40LT转导的脂肪形成相关基因的表达显著增加(图3A)，CTR组、GFP组和SV40组的IPFSCs在体外诱导分化21d后证实了这一结果。数据显示在SV40LT转导后IPFSCs成脂分化明显增加，成脂标记基因LPL、CEBPA和PPARG的表达高于第5、10和15代CTR和GFP组(图3B)。研究还发现成脂能力以一种传代依赖的方式下降(图3B)，SV40LT转导后IPFSCs在mRNA水平的表达变化被蛋白质水平证实，其中油红O染色强度最强，表明脂滴最多(图3C)，Western blot分析显示LPL的表达最高(图3D)。
3.SV40LT转导细胞基质DECM对IPFSCs增殖的影响
为确定扩增对SV40LT转导细胞沉积的细胞外基质(DECM)增殖能力的影响，采用细胞形态学、细胞生长速率、细胞周期、MSC表面标志物以及衰老相关基因对IPFSCs进行了检测。与那些生长在TCP上的细胞相比，dECM扩增的IPFSCs显示出一个闪亮的细胞表面(图4A)。DECM扩增增加了细胞数量，特别是SV40LT转导细胞沉积的细胞(图4B)，这与细胞周期数据(图4C)一致。与TCP上的IPFSCs相比，dECM扩增的IPFSCs中上调的基因始终丰富在与细胞增殖和细胞运动等生物学过程相关的基因本体中(图4D)。有趣的是，流式细胞术结果显示，经dECMs扩增后，IPFSCs中CD73、CD90和CD105的表达降低，SSEA4的表达增加(图4E)。QPCR数据显示，dECM扩增的细胞通常表现出更高的茎基因表达水平；与非SV40LT转导细胞相比，经SV40LT转导的细胞在dECM上扩增后，IPFSCs的SOX2和NES水平较高，KLF4和MYC的表达较低(图4F)。此外，与TCP培养的细胞相比，dECM扩增细胞的衰老相关基因TP53、CDKN1A和CDKN2A的表达水平更高，而SV40LT转导细胞的dECM扩增降低了IPFSCs衰老相关基因的表达(图4G)。
4.SV40LT转导细胞基质DECM对IPFSCs成软骨能力的影响
通过在TCP或DECMs上扩增的IPFSCs检测与软骨形成相关的基因集上表达的变化(图5)。分析表明，与CC组(扩增细胞对照组)和C15C(第15代IPFSCs)组相比较，C5C(第5代IPFSCs)组、S15C（SV40LT转导第15代IPFSCs）与S5C（SV40LT转导第5代IPFSCs）组软骨细胞发育基因上调(图5A)。S15C组在与软骨形成相关的基因也表现出比C15C组更高的表达水平，这些基因包括蛋白质羟基化、通过果糖6磷酸(F6P)的糖酵解、细胞外基质成分、肽基脯氨酸修饰、蛋白质折叠伴侣和胶原三聚体(图5B)。为证实上述观察结果，将扩增的细胞在软骨诱导下培养30d，用qPCR检测成软骨标志物基因的表达，然后用Alcian蓝染色检测硫酸基氨基半乳糖(GAG)，免疫组织化学染色检测Ⅱ型胶原(II型胶原)。发现尽管在dECM扩增后0天的IPFSCs小球中SOX9和COL2A1表达上调，Acan表达下调，但在低传代细胞(C5C)或SV40LT转导细胞(S5C和S15C)沉积的DECM上扩展产生的小球(分别称为C5P、S5P和S15P)与TCP组相比，SOX9、COL2A1、ACAN和PRG4的表达更高。经dECM预处理后，S15C组的成软骨标志物基因表达水平最高，S5C组次之，C15C组最低(图6A)。与上述mRNA数据一致，dECM扩增细胞产生的颗粒比在TCP上生长的颗粒更大，硫酸化GAG和II型胶原的染色更深(图6B)。在软骨诱导中，高传代细胞(C15P)所沉积的dECM对扩增的IPFSCs的作用比低传代细胞(C5P)所沉积的dECM弱；SV40LT转导细胞(S5P和S15P)所沉积的dECM与非SV40LT转导细胞(C5P和C15P)所沉积的dECM相比，对扩增的IPFSCs的作用进一步增强；C5P和C15P所沉积的dECM对扩增的IPFSCs的作用更强。
5. SV40LT转导细胞基质dECM对IPFSCs成脂能力的影响
GSEA和RNAseq数据表明，与C15C相比，S15C在与脂肪形成的相关基因组上的表达水平降低(图7A)。体外诱导扩增细胞在成脂培养基中诱导21d后，用qPCR检测成脂标志物基因的表达，Western blot检测LPL在蛋白水平的表达，油红O染色检测脂滴，证实了这一发现。QPCR结果表明，DECM扩增降低了IPFSCs成脂标志物基因LPL、CEBPA和PPARG的表达，尤其是高传代细胞(C15A)或SV40LT转导细胞沉积的DECM(图7B)。Western blot数据显示，与在TCP上生长相比，在成脂诱导后， dECMs上扩增的IPFSCs LPL表达减少，特别是高传代细胞沉积的dECM(图7C)，尽管不同组之间的脂滴染色没有太大差异(图7D)。
6. 基质和SV40介导的干细胞命运决定的潜在机制
非靶向蛋白质组学分析从DECMs、扩增细胞和颗粒样品中累计鉴定出23156个独特多肽中的3060个蛋白质,共鉴定出188个与基质相关的蛋白质，包括细胞外基质相关蛋白、分泌因子和细胞外基质调节因子；无标记定量(LFQ)值用于样品之间的相对比较。典型基质蛋白的免疫荧光染色显示，在SV40LT IPFSCs沉积的DECM中，层粘连蛋白和IV型胶原的表达显著增加，而纤维连接蛋白的表达略有增加，尤其是那些由高传代细胞(S15E)沉积的DECM(图8A)。蛋白质组学数据反映了这一染色结果，在SV40LT转导细胞沉积的dECM中，基底膜蛋白(图8B)显著增加，其中COL4A1、COL4A2、NID2(NID2)和层粘连蛋白β1(Lamb1)的表达比相应的对照增加了2到10倍。有趣的是，LAMB2的趋势与免疫染色的粗层粘连蛋白信号(图8A)和Lamb1信号(图8B)相反，可能表明层粘连蛋白异源三聚体的组成随着永生化而发生变化；此外，SV40LT细胞沉积的dECM中的多模块基质蛋白TNC比相应的对照组增加了至少四倍(图8B)。FN1的LFQ值证实了免疫荧光信号，SV40LT细胞沉积的dECM略有增加(图8A)。dECMs的蛋白质组学分析表明，经SV40转导的IPFSCs所沉积的dECM具有良好的基底膜蛋白(B1)和基质蛋白(B2)的表达。在扩增细胞对照组(CC)中，具有中断的三螺旋的原纤维相关胶原(FACIT)信号最高(图8D)。在扩增细胞对照组(CC)中，具有中断三螺旋(FFAIT)信号的纤维相关胶原信号最高(图8D)；然而，在高传代SV40LT转导细胞沉积的dECM上进行软骨诱导后，IPFSCs产生了FFAIT胶原(图8E)以及软骨形成标志物ACAN(增加四倍以上)和COL2A1(增加两倍以上)的表达小球(S15P)。
讨论
供体年龄和长期体外培养都是骨髓间充质干细胞衰老的原因，也是基于干细胞的组织工程和再生的挑战。以前的报告表明，SV40转导可以使原代细胞永生化，但在分化能力方面有相互矛盾的结果。在本研究中，发现SV40LT转导产生了具有显著改善的增殖和成脂分化能力的IPFSCs，然而，软骨形成能力显著降低;数据还表明，SV40LT转导的IPFSCs有5%的异常染色体，因此使用SV40LT转导的细胞进行临床治疗是不现实的。越来越多的证据表明，dECM是一种潜在的培养基质，可扩大骨髓间充质干细胞用于再生和组织再生。年轻供体的dECM比老供体的dECM具有更好的再生效果；然而，大多数患者年龄较大，来自年轻供体的异基因/异种dECM来源可能会引起免疫问题。在这项研究中发现dECM的扩增显著促进了高传代IPFSC的增殖。令人惊讶的是，在dECM上扩增的IPFSCs产生了相反的分化趋势，即成脂能力降低但成软骨能力增加，特别是那些由SV40LT转导的高传代IPFSCs沉积的细胞。
研究发现SV40LT转导导致p53在RNA和蛋白质水平的上调，以及CDKN2A表达的显著增加。据报道，作为细胞周期调节中的一个关键角色，p14ARF被癌基因激活，导致p53的稳定和积累。相比之下，CDKN1A在SV40LT转导IPFSCs中显示出完全相反的趋势，因为与对照组相比，表达显著降低。p21是一种细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂，可引起G1期或G2期DNA复制的有效G1阻滞和阻断，p21也是p53在细胞周期停滞中的主要靶点。在这种情况下，转导的SV40LT刺激可以上调CDKN2A的表达，导致TP53积累和CDKN1A表达的随之减少，导致增殖潜力显著增强，这也得到G2和S期细胞百分比增加以及干细胞基因表达上调的支持。
使用基因修饰的永生化是对抗细胞衰老的有效方法；然而，有致癌的可能性。在本研究中，发现SV40LT转导后人IPFSCs的异常核型，这引起了对将转导细胞本身用于临床应用的安全性的关注。发现在dECM上的扩增，特别是来自SV40LT转导细胞的扩增，产生了比TCP扩增具有更好增殖能力的IPFSCs。蛋白质组学数据显示，基底膜蛋白可能会参与干细胞增殖和干细胞维持，而有一项研究表明，由骨髓间充质干细胞和脂肪来源的基质细胞沉积的dECM增强了骨髓间充质干细胞的增殖能力，这进一步保证了使用这些扩增底物进行干细胞再生的安全性。
SV40LT永生化被发现显著降低了软骨形成潜能，但增加了人IPFSCs的肥大。我们还发现SV40LT永生化显著增加了人脂肪间充质干细胞的成脂潜能，这一发现与以前的报告不一致，在以前的报告中，从SV40转基因小鼠的腹股沟皮下白色脂肪组织(WAT)中分离出的原代脂肪细胞前体细胞与野生型小鼠相比，在对外部诱导的反应中显示出降低的成脂能力，野生型SV40LT有效地阻断了前脂肪细胞的成脂分化。有证据表明，来自棕色脂肪组织的前脂肪细胞的反应与来自水的不同，例如，SV40转导的BAT前脂肪细胞可以分化为脂肪细胞；然而，SV40转导的WAT前脂肪细胞将失去其成脂能力，可能是由于SV40LT转导细胞中p300/CBP环磷酸腺苷反应元件结合蛋白的失活。
在dECM实验中，发现低传代细胞在dECM上的扩增促进了扩增细胞的成软骨潜能，而高传代细胞在dECM上的扩增产生了成软骨分化显著降低的成软骨细胞，尽管dECM扩增和TCP扩增相比都增加了细胞增殖。这一发现与以前的一份报告一致。有趣的是，在SV40LT转导细胞沉积的dECM上的扩增产生了具有显著更高软骨形成能力的间充质干细胞，特别是对于高传代间充质干细胞沉积的dECM。这一发现可能与软骨形成调控中翻译后修饰的潜在参与有关。这种内部基因的改变可能是由外部微环境的变化引起的，蛋白质组学结果表明，与相应的dECM组相比，基底膜蛋白和其他蛋白如转化生长因子β诱导的蛋白TGFBI沉积更多。越来越多的证据表明，基底膜蛋白如层粘连蛋白参与软骨形成，表明基底膜蛋白在干细胞软骨形成分化中的重要性。据报道，TGFBI是一种由TGFβ诱导的多功能基质分子，可促进软骨前细胞粘附和生长，并抑制软骨内骨化。在这种情况下，这些蛋白质的富集为扩增的IPFSCs创造了软骨形成谱系特异性的“生态位”，这可能是高传代IPFSCs在SV40LT转导的高传代细胞上扩增后向软骨形成谱系分化能力优异的原因。
尽管SV40LT转导的脂肪间充质干细胞显示出更强的成脂分化能力，但在dECMs上生长的高传代脂肪间充质干细胞却获得了相反的结果，即成脂能力受损，这一结论与以前的发现一致，即在由IPFSCs或SDSCs沉积的dECM上的扩增抑制了IPFSCs的成脂分化，而在由骨髓间充质干细胞沉积的dECM上的扩增产生了具有降低的成脂能力的人骨髓间充质干细胞。这种成脂分化的减少可能与细胞外基质的“自发”分化抑制作用有关，因为细胞外基质被证明与细胞表面受体相互作用并调节生长因子的活性，抑制血清中生长因子的吸收。
结论
本研究首次表明SV40LT在人IPFSCs中的转导不仅促进了细胞增殖，而且增加了成脂潜能，降低了成软骨潜能；此外，研究还发现SV40LT转导的IPFSCs沉积的dECM通过提高成软骨潜能和降低成脂能力逆转了扩增的IPFSCs的分化偏好。尽管高传代SV40LT转导细胞沉积的细胞外基质的复壮作用尚不清楚，但本研究为深入研究细胞外基质蛋白提供了一个很有前途的模型，以确定这些基质蛋白如何影响周围干细胞的分化偏好。