科研│ PNAS(IF: 9.412):单细胞分辨率下的植物干细胞的组织和分化
编译:萌依依,编辑:景行、江舜尧。
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植物在茎尖分生组织(SAM)中存在维持着多能干细胞的群体,这些干细胞不断地产生新的地上器官。本研究使用单细胞RNA测序(scRNA-seq)对玉米茎干细胞生态位及其分化的细胞后代转录图谱进行了表征。位于SAM顶端的干细胞负责维持基因组的完整性,并且细胞分裂率较低,这与它们对生殖系和体细胞命运的贡献是一致的。令人惊讶的是,研究者没有发现标准的干细胞组织中心替代这些细胞的证据。此外,通过轨迹推断追踪伴随细胞分化的基因表达变化,发现KNOTTED1(KN1)的异源表达加速了细胞分化,促进了玉米叶原基的发育。对茎尖的单细胞转录解析了玉米幼苗中干细胞的功能和细胞命运的获得过程,并为细胞水平上剖析植物茎形态发生的遗传控制提供了更具价值的框架。
论文ID
原名:Plant stem-cell organization and differentiation at single-cell resolution
译名:单细胞分辨率下的植物干细胞的组织和分化
期刊:Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America
IF:9.412
发表时间:2020年12月
通讯作者:程涛;Berthold Göttgens
通讯作者单位:Michael J. Scanlon
DOI号:10.1073/pnas.2018788117
实验设计
结果
1 单细胞转录技术在玉米SAM细胞分析中的应用
为了从显微镜下的幼苗SAM中捕获细胞,研究者手工采集了SAM和最近的两个初始叶原基 (SAM+P2) 组成的顶端原生质体。经过筛选,6个生物重复总共捕获了327个细胞进行scRNA-seq分析(中值转录本=8955,基因中值=2221)(图1A和SI附录,图S2)。根据已知的茎尖标记基因(数据集S2)的表达将细胞类型标识分配给集群,并确定了与来自表皮、叶原基和维管的主要细胞类型集群,以及来自SAM的不确定的细胞类型(图1B和SI附录,图S3)。有趣的是,大多数富含SAM的细胞不是形成离散的、孤立的细胞团,而是表现出一系列中间状态身份的连续体(图1B),这表明玉米SAM和叶原基的分化是高度动态和连续的。
2 玉米干细胞间基因组完整性的调控
玉米SAM的顶端被认为含有干细胞。细胞聚类分析独立地鉴定了一个转录上不同的细胞群体,其中DYNAMIN (DYN),一种先前在玉米SAM中发现的尖端细胞的标记,在表达KN1更广泛的分生细胞群体中上调(图1C-E)(4)。因此,将属于该簇的细胞认定为保留在SAM尖端的假定干细胞,并使用差异表达(DE)分析来鉴定该群体中优先表达的89个基因(图1F和数据集S4)。其中一些基因在细胞间信号转导、小RNA生物发生、DNA维持、对植物激素生长素和细胞分裂素的响应以及转录调控中具有明确或预测作用(图1F)。
图1.玉米SAM中干细胞识别和维持的转录特征。(A)细胞分离自SAM和两个最近初始的叶原基(SAM+P2)。(B)对SAM+P2数据集中的单元进行降维和单元分类。 (C)SAM内侧纵切面动力蛋白(Dyn)反义探针RNA原位杂交。(D)DYN 是一种SAM尖端和干细胞结构域的标记,在SAM+P2数据集中表达与推测的TIP细胞群相关。(E)KN1的表达标志着包括尖端细胞群体在内的更广泛的不确定细胞群体。(F)基于功能本体分组的在TIP结构域中差异表达基因的热图。
3 在SAM干细胞群体中,细胞分裂率保持在较低水平
研究者考察了玉米SAM顶端的干细胞是否表现出细胞分裂率的差异。在细胞周期回归过程中产生的细胞周期表明处于G1期的SAM+P2细胞的比例随着分化的进行而减少,这表明细胞分裂率较高(图2A)。为了验证这一点,对分别在S期和G2/M期细胞中积累的HISTONE H3和CYCLIN1转录本进行了RNA原位杂交。接下来,将内侧SAM切片沿着近端轴线细分为5个等高的部分,并通过HISTONE H3和CYCLIN1染色的图像阈值推断细胞分裂阶段的空间分布(图2B-E)。bin 1包含SAM最顶端区域的细胞,它始终具有最低数量的分裂细胞。当同时考虑SAM末端检测到的促进基因组和表观基因组稳定性的转录,这种低分裂率可以解释在个体发育早期没有分离种系的情况下,植物如何避免连续几代遗传负荷的不利增加(图1F)。扩充细胞中的这些增殖细胞分裂产生了决定侧向器官的胶原,从而消除了对干细胞分裂的高比率的要求。最后观察到,在腋下分生组织(AM)中,分裂细胞的最高浓度通常发生在AM顶端附近,而不是SAM(图2D),这表明细胞分裂模式在不同的茎分生组织中受到动态调节。
图2. 整个玉米SAM过程中的细胞分裂动态。(A)估计SAM+P2数据集中细胞的分裂阶段。条形图显示了细胞团中每个阶段的细胞比例。(B和C)用反义探针对H3(B;SAM,n=9;AM,n=4)和CYC1(C;SAM,n=7)进行RNA原位杂交,在SAM的内侧纵切切片上显示条带(虚线网格,编号),用于定量(D)S期和(E)G2/M期细胞的比例。
4 SAM干细胞调控的差异
FON2-LIKE CLE PROTEIN1 (FCP1)是在分生组织顶端细胞中唯一检测到的CLV3-like配体转录本。RNA原位杂交检测到FCP1在SAM尖端下方的弱表达,以及在SAM外围和叶原基中的表达。FEA3转录本显示在SAM外围低水平和弥漫性积累,而在叶原基中高度表达(图3B)。编码预测的富含亮氨酸重复序列(LRR)受体的其他玉米转录本显示出类似的积累模式(数据集S4),在SAM外围和原基中表达较高,但缺乏与拟南芥CLV1相同的强SAM特异性表达谱。
在拟南芥中,干细胞促进转录因子WUSCHEL (WUS)受到CLV1-CLV3功能的负调控,以控制分生组织干细胞池的大小。然而,研究者没有在SAM中检测到ZmWUS表达的细胞 (图3C)。总体而言,玉米同源基因WOX9b和WOX9c在功能上不太可能与WUS同源。此外,尽管WOX3A确实编码WUS盒在SAM(图3C)中检测到,但其表达模式不是细胞类型特异性的,与明确定义的生发中心(OC)不一致。因此,研究数据在玉米B73 SAM中没有发现可能作为干细胞组织中心表达的、与拟南芥同源的候选WOX基因。
为了扩大这些发现,研究者进行了RT-PCR分析,试图检测ZmWUS1和ZmWUS2转录本的积累,但没有检测到它们在营养枝顶端组织中的表达,这些组织包括SAM和最近启动的三个叶原基(图3D)。综上所述,这些结果表明,典型的CLV1-CLV3-WUS途径在玉米B73 SAM中被绕过,相应的玉米同源基因的空间表达模式的变化是一个明显的特征。
5 玉米HAM-LIKE基因在SAM核心中的WUS非依赖性功能
为了进一步研究玉米SAM的组织结构,研究者分析了最近报道的位于SAM中心或“核心”区域的细胞中的基因表达模式。通过GRMZM2G049151(UNKNOW [UNK])的转录积累鉴定了核心区内的细胞,并用DE分析鉴定了它们的表达谱(图3E和F以及数据集S5)。SAM核心细胞显示PLA1(PlastochRON1)基因表达上调。事实上,对SAM中细胞分裂动力学的分析表明,相对于SAM尖端,核心区具有更高的细胞增殖活性(图2)。生长素促进的休眠相关基因DRM1和玉米毛状MERISTEM3(HAM3)同源基因GRAS33也在SAM核心上调,RNA原位杂交证实(图3F-H和SI附录,图S4B和C)。拟南芥Ham基因在组织中心、SAM外围和叶原基中表达。
为了确定GRAS33核心区的活性是否在玉米SAM的维持中起到保守的作用,在GRAS33及其伴生的GRAS32之间产生了双突变体,并分析了幼苗中的SAM大小(SI附录,图S4A)。与野生型(WT)同胞相比,gr3as2/+gr33幼苗和gras32 gras33双突变体的SAM较短(图3I-K)。只有GRAS32-GRAS33 SAM具有较短的AM,这可能是由于AM中这些因子之间的遗传冗余(图3L)。这些数据表明,玉米GRAS32和GRAS33和它们的拟南芥同源物一样,具有调节SAM动态平衡的作用。
这些结果进一步表明,与拟南芥不同,玉米的SAM尖端不受WUS表达的干细胞组织中心的影响。相反,这个SAM核心区显示了生长素调节的生长过程的信号,正如PLA1和DRM1表达上调所表明的那样。因此,玉米SAM核心可能具有类似于拟南芥中表达HAM的顶端替代SAM区域,其HAM基因具有潜在的不依赖于WUS的SAM调节功能。
图3.SAM核心的特性。(A-C)与针对FCP1(A)、FEA3(B)和WOX9c(C)的反义探针(Top)进行RNA原位杂交,并在SAM+P2数据集中进行DE分析和Paralog基因表达(下图)。(D)从玉米SAM和最近启动的三个最新启动的叶原基(SAM)、2 mm幼穗(EAR)、成熟叶3组织(叶)、基因组DNA(GDNA)和无模板对照(水)中获得ZmWUS1/2、GAPDH和KN1转录本的RT-PCR。(E)SAM+P2数据集中表达未知标记基因的细胞。(F)火山图显示表达未知SAM核心标记基因的细胞中基因(蓝色)的差异表达。(G和H)反义探针与SAM中GRAS33(G)和DRM1(H)的RNA原位杂交。(I和J)甲苯胺蓝-O染色的正常同胞(I)和GRAS32 GRAP33双突变体(J)的SAM内侧纵切面。
6 细胞分化中的一系列转录状态
研究者应用主图算法识别之间的分支路径在UMAP投影中嵌入单元格坐标,来推断SAM+P2数据集中细胞的分化轨迹。然后,每个单元基于沿路径的距离(相对于SAM尖端单元群体内指定的假定时间起始位置)被分配一个假定时间值(图4A)。正如预期的那样,发现假定时间级数与细胞从不确定的细胞命运转变有关;KN1是不确定分生组织同一性的关键标记,在假定时间早期高度表达,并随着假定时间的进展而下降(图4A)。为了调查与细胞分化相关的转录变化,研究者进行了DE分析。对每个转录本进行等级聚类根据表达模式分组,并确定了与细胞分化的特定阶段相对应的几种转录本积累模式(图4B)。
注定发育为叶原基和/或维管系统的细胞表现出与细胞壁、叶绿体、器官发育和细胞增殖相关的生长素反应基因和转录本的上调。此外伴随着叶片的启动和扩展,蛋白质合成出现了较大的爆发。通过RNA原位杂交来验证与假定时间进展相关的基因沿着发育轨迹的表达模式如图4C-F)。
在假定时间早期表达的一个基因,ZINC DOMAINLIKE(ZNF-like),在SAM末端显示表达(图4C)。同时,FLOWERING PROMOTING FACTOR1-LIKE (FPF1-LIKE)和WALLS ARE THIN1-LIKE (WAT1-LIKE) 转录本在假定时间后期上调,并在维管系统和叶缘细胞的分化过程中积累(图4D和E)。最后,HYBRID PROLINE-RICH PROTEIN11(HYP1)转录本也在晚些时候上调 (图4F)。总之,这些结果表明分化细胞的转录本一个由假定时间级数定义、高度动态的连续体。
7 决定不确定和确定细胞命运的基因在叶片个体发育过程中表达
为了分析这个晚期模式和分化过程,研究者准备了包含SAM ~3mm的玉米茎尖的组织,从2周龄的幼苗中分离出来,联通最近启动的六个叶原基加上SAM (SAM+P6;SI附录,图S5A)进行scRNA-seq分析。总共捕获了12,967个原生质体的转录本 (中位数转录本=14,992个,中位数基因=4,965个)。
SAM+P6数据集中的细胞绝大多数来自芽个体发育的后期(即P4到P6),这是由于这些较老的叶原基和相关茎的大小显著增加。尽管根据转录因子基因KN1的表达来识别不确定细胞(SI附录,图S7C),在SAM+P6数据集中,没有识别出具有幼苗SAM干细胞生态位转录标志的细胞(图1C-F)。尽管如此,但还是确定了许多从不确定的细胞命运到确定的细胞命运转变的特征(SI附录,图S9)。
研究者再次使用轨迹推断为细胞分配一个反映它们在不确定到确定转变中位置的假定时间值,并利用DE分析来识别具有假定时间相关表达模式的基因(图4G)。发现在两个数据集中,大约三分之一的转录本与假定时间显示出显著的相关性,这表明一个基因的核心模块控制着个体发育中不确定到确定的细胞转变,其中包括KN1(图4H和数据集S10)。此外,在两个数据集中,相同基因的表达曲线比不相同基因的中位Fréchet距离更低,这表明个体发育过程中的表达行为相似(图4I)。
8 异位表达的KN1通过促进鞘细胞命运加速叶细胞分化
KN1中显性功能突变使其在发育的叶原基中错误表达,导致叶片组织中间异位鞘的形成。为了支持这一模型,研究发现Kn1-o/+幼苗与WT相比,鞘长显著增加(图5A)。在Kn1-O/+植物中,在叶片中出现了异位鞘组织结,并在这一异位叶片-鞘边界形成了相邻的叶舌(图5B和SI附录,图5S11)。然而在Kn1-o lg1双重突变体中,在这些异位的叶片-鞘边界上没有形成叶舌,这进一步证明了Kn1-o/+突变体叶片中包含错位的鞘状来源斑块(图5B和SI附录,图S11)。
为了研究异位KN1表达对玉米幼苗芽假定时间进程的影响,从正常的WT和Kn1-O/+同胞SAM+P6组织中分离出原生质体,并对它们进行scRNA-seq。虽然KN1及其直接靶标GA2OX1主要在WT的不确定细胞中表达,但这两个基因在Kn1-O/+背景下的确定细胞类型中表达更广泛(图5C)。轨迹重建显示Kn1-O/+相对于WT细胞群体的细胞命运进程发生了转变(图5D和E)。令人惊讶的是,来自Kn1-O/+背景的细胞在假定时间进程中明显比WT细胞提前(图5F),这表明叶片中的KN1活动促进了细胞分化,而不是推迟了细胞分化。
正如预期的那样,GA2OX1的异位表达与KN1表达的增加有关(图5G)。然而,我们也检测到关键的促进基因的表达上调。综上所述,这些结果表明,当KN1在叶片中错误表达时,它促进了鞘细胞的分化,并加速了叶片发育的个体发育进程,这反映在假定时间内细胞转录的变化(图5H)。
讨论
在这里,研究者提出了一个植物营养茎尖的包括SAM内的干细胞的单细胞转录研究。这项技术的优势是以一种公正的方式揭示细胞类型,而不是严格依赖于组织学或遗传标记。重要的是,发现了已知的和潜在的SAM干细胞生态位的标记,并表明它的特征是DNA甲基化和DNA修复相关基因的上调,以及低细胞分裂率。
同时发现与其他被子植物不同的是,B73玉米自交系营养SAM中缺乏WUS表达组织中心,这表明具有其他非标准的干细胞组织功能的基因可能发挥作用。此外,通过利用细胞的连续体,从不确定的细胞特性到确定的细胞特性,重建了幼苗营养茎尖细胞的分化轨迹,为茎细胞分化提供了前所未有的分辨率。
令人惊讶的是,研究者还发现,通过异位表达同源框转录因子基因KN1来干扰芽的分化过程会加速而不是延缓幼苗芽中的细胞分化。这与以前的KN1作用模型不同。研究者认为,异位KN1的表达通过促进鞘组织的增加和/或早熟,加速了单子叶玉米叶片的假定时间进程。值得注意的是,鞘是玉米叶片的最后一部分,从腺泡和茎中长出,也是最后伸长的部分。这样野生型SAM+P6幼苗样品中的玉米幼叶原基主要由注定形成叶片的细胞组成。多项研究已经注意到,KN1转录本和蛋白从P0开始在玉米叶原基的极近端基部积累,并得出结论“KN1在这些叶基中确定近端鞘的身份”的结论。事实上,对极性生长素运输抑制剂的研究表明,鞘的最近端直到P4才从茎的中间分生组织中出现。虽然这些近端的鞘细胞更具“分生组织”的意义,但鞘细胞分化命运的获得发生在叶片发育的后期。因此,研究者提出了一个模型,即KN1的错误表达通过促进幼叶原基中的异位鞘斑块来促进叶片的个体发育(图5H),从而加速玉米叶片中细胞的命运分化进程。
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