科研| Plant Cell: 甘蓝型油菜胚的细胞可塑性对存储蛋白抑制的响应

编译：Nicole，编辑：夏甘草、江舜尧。

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导读

细胞结构主要取决于各种亚细胞细胞器的大小，数量和位置。在油菜（甘蓝型油菜）的种子中，薄壁组织细胞负责以脂滴形式积累三酰基甘油（TAG）的合成，十字花科植物蛋白占种子总蛋白质含量的60％。脂质含量约占种子干重的一半，且主要以TAG的形式存在。因此，发育中种子的代谢主要由参与TAG和存储蛋白合成的酶和转运蛋白组成。氨基酸是构建种子储存蛋白的基础，蔗糖既可以转化为脂肪酸，也可以转化为TAG。甘油脂和贮藏蛋白在种子发育过程中同时在内质网（ER）中组装，因此可能竞争有限的资源，包括前体和辅因子。此外，胚胎中积累的部位重叠，这表明蛋白质合成中的变化可能影响脂质合成。通过显示某些基因位点影响油菜双歧杆菌种子的蛋白质和脂质含量，但相反的方向，也已经确定了脂质与蛋白质代谢之间存在串扰的现象。正如育种家所指出的那样，成熟种子的脂质含量往往与蛋白质的含量呈负相关。的确，在油菜中，发现编码某些贮藏蛋白的基因的阻遏有利于其他贮藏蛋白的补偿性合成，而不是促进脂质的积累。碳分配和中枢新陈代谢的变化仍然非常难以设计，种子中油和蛋白质存储之间的联系尚不清楚。甘蓝型油菜是最重要且广泛种植的温带油料作物之一。增加其种子脂质含量仍然是许多育种计划的主要目标。本文通过使用RNAi和磷酸烯醇丙酮酸羧化酶转基因抑制编码两种主要存储蛋白（napin和十字花科素）。这些转基因植物的发育种子在转录组，蛋白质组学，代谢组学和脂质组学水平上进行了表征，并使用显微镜，核磁共振和质谱成像探索了RNAi抑制的可见后果。通量平衡分析预测了代谢通量和能量辅因子的需求。在超微结构、分子和代谢水平上的众多变化的阐释细胞和代谢可塑性机理。

论文ID

原名: Cellular Plasticity in Response to Suppression of Storage Proteins in the Brassica napus Embryo

译名: 甘蓝型油菜胚的细胞可塑性对存储蛋白抑制的响应

期刊: Plant Cell

IF: 9.618（1区）

发表时间:2020.4.30

通讯作者: Ljudmilla Borisjuk

通讯作者单位: 德国莱布尼茨植物基因和作物植物研究所

DOI号: 10.1105/tpc.19.00879

背景

为了同时下调编码PEPC1、PEPC2、napin和十字花素的基因，根据Glimelius等人的研究，从甘蓝型油菜品种PPS02-144B两天生幼苗的下胚轴中分离出原生质体。然后与携带二元载体pTJCL032的农杆菌C58C1Rif（pGV4000）共培养3天。并进行转化，获得转基因植株。随后进行Southern、MRI、表达组和蛋白组等分析。

结果

1.  RNAi抑制napin和十字花青素合成的有效性

甘蓝型油菜中的贮藏蛋白由许多基因编码，我们鉴定了8个编码十字花科蛋白P1，P2和P3子家族的基因，这些基因均存在发夹结构。对于napin，鉴定出的17个基因；对于磷酸烯醇丙酮酸羧化酶（PEPC），鉴定出的11个基因。通过RT-qPCR对三种独立的转基因株系（＃576，＃578和＃580）进行RT-qPCR，评估了RNAi在发育中的胚胎中靶向基因的有效性，并与它们各自的野生型进行了比较（图1A-C）。由编码各种十字花青素的不同基因产生的转录本最多减少了32倍（log2值为-5，图1A）。对于napins，抑制程度甚至更高，如图1B所示的三个napin编码基因。在RNA测序数据集中，其他靶向的napin和十字花青素编码基因的抑制作用变得明显。时间序列分析表明，下调的程度在种子灌装的后期最为明显（图1D）。PEPC的抑制水平在转录丰度和酶活性水平均处于临界水平（图1C，E）。因此，PEPC RNAi构建无效。

图1：通过引入RNAi结构来抑制十字花素和napin的效果。

2. RNAi方法可改变成熟种子的组成，但不会改变碳/氮比

转基因植物的可见表型与WTS植物具有基本相同的表型。种子含量的测量显示，成熟的转基因种子比WTS种子少10-15％的蛋白质和脂质，而纤维多30-35％（图1F-H）。进一步的成分分析表明，转基因种子的总氮含量和碳氮比没有变化，而水分含量在统计学上降低了约9％。淀粉含量低于干重的1％，而转基因和WT品系没有任何一致的变化。抑制napin和十字花科素的产生会降低成熟种子的胚部分。成熟时，尽管种子大小几乎没有差异，但转基因种子的重量比WTS种子低（图2B）。为了确定由于RNAi抑制十字花科素和napin蛋白而可能在内部造成的变化，磁共振成像（MRI）用于无创地观察种子的内部结构。MRI显示，成熟的转基因种子的子叶形状不规则，并留有许多充满空气的空腔（空隙），如图2A所示。空隙空间的体积比WTS种子大得多（n = 8-12个种子，图2E），高62-73％。当使用MRI分析时，转基因胚胎比WTS小7-9％（图2C），种皮的体积大5-8％（图2D）。这导致转基因种子中的胚与种皮的比率降低，从而导致种子组成发生变化（图2F）。

图2：通过引入RNAi结构物抑制十字花素和油菜花苷对种子表型的影响。

3. Napin和十字花青素的缺失明显改变了细胞内部结构

在转基因和WTS植物的胚胎中观察到亚细胞组织的显著差异。在发育的早期阶段，WTS胚胎中的薄壁细胞已经具有众多的蛋白质体，这些蛋白质体在种子发育过程中不断扩展（图3A，C，E）。相比之下，在转基因胚胎中，仅在种子发育后期才检测到蛋白质体，其蛋白质大小仍显着变小（图3B，D，F和补充图3）。WTS胚中形成的蛋白质体被密集堆积的脂质液滴包围（图4A）。免疫标记法证实，napin和十字花科素都与WTS蛋白体有关（图4C，D），而油质蛋白与脂滴相关（图4B）。在转基因胚胎的细胞中，十字花青素的丰度大大降低，并且存在的蛋白质散布在整个蛋白质体中（图4H），而napin几乎检测不到（图4G）。另一方面，油质蛋白在脂滴和整个膜堆中都很好地存在于转基因胚的细胞中（图4F）。上文所述＃580转基因株系与其WTS相比，胞内结构的所有主要变化，＃581对其他转基因品系也很明显。

图3：种子胚贮藏组织的精细结构。

图4：胚保存组织的超微结构。

4. 转基因种子的贮藏和膜脂都发生了改变

尽管种子大小与WTS相似，但使用MRI对完整成熟种子的脂质进行的MRI分析显示，两种转基因品系中的总脂质含量均降低了约20％。关于脂质分布，子叶积累的脂质相对于胚根的比例更高。发育中种子的质谱分析显示，TAG的数量和组成以及常见的膜脂磷脂酰胆碱（PC）均受抑制萘啶和十字花青素生成的影响（图5A）。在植物中，PC既是膜的结构成分，又是TAG合成的重要代谢前体。转基因品系＃580的种子中PC的数量比WTS品系＃581的种子中PC的数量几乎高出四倍，而TAGs的数量在转基因种子中降低了约20％。对于这两种类型的脂质，其饱和水平都有明显的变化。与WTS种子相比，转基因种子脂质提取物中PC和TAG中的多不饱和脂肪酸含量更高（图5B）。基于质谱（MS）的种子切片成像证实，相对于TAG和PC，转基因种子的饱和度显着降低，并且还强调了脂质分子种类在不同组织中的异质分布（图5C）。

图5：种子贮藏和膜脂的水平和分布

5. 比较转录组分析表明基因表达发生重大变化

RNA序列分析检测到来自67,885个蛋白质编码基因的转录本。转基因（品系＃580）与其WTS（品系）之间的转录本丰度显示转基因中94个基因被下调，而97个基因被上调。＃580（转基因）品系中来自预测编码napin的12个基因和七个编码十字花科素的基因的转录丰度显着低于＃581（WTS）品系（图6A）。在转基因中，许多编码与硫同化相关的蛋白质的基因被下调，已知其中9个基因的拟南芥直系同源基因（At1g04770，At5g48850，At1g36370）被硫诱导。硫酸盐还原成H2S的几个基因的转录本丰度也降低了。他们的拟南芥的直系同源物编码叶绿体包膜的硫酸盐转运蛋白（AT5G13550），ATP硫酸化酶的叶绿体异构体（AT3G22890），5'-腺苷酸硫酸还原酶（AT1G62180）和亚硫酸盐还原酶（AT5G04590）。这套下调的基因还包括两个拟南芥的拟南芥直系同源基因，它们编码腺苷酸硫酸盐激酶（AT2G14750），提供次级代谢产物合成的活化硫酸盐的酶，以及编码丝氨酸乙酰基转移酶的基因（AT2G17640），一种在半胱氨酸合成中具有活性的酶。在上调的基因中，编码油质蛋白的基因倾向于在转基因中以比WTS系更高的水平表达（图6B）。基因家族的几个成员编码非特异性脂质转移蛋白（LTP）的编码在转基因品系＃580（补充数据集2D）中上调，其中最丰富的是BnaC04g30640D（拟南芥。At3g59970，编码亚甲基四氢叶酸还原酶（C1代谢）的拟南芥基因的油菜假单胞菌直系同源基因在转基因胚中被上调，并且它们的产物在蛋白质组学水平上更为丰富。

图6:RNAi转基因对转录组的影响。

6. Napin和十字花科蛋白损失引起的蛋白质组重新平衡导致油质蛋白过度积累

基于二维凝胶电泳的蛋白质组谱分析能够鉴定甘蓝型油菜胚胎中1,124种不同的蛋白质。根据基于MS的分析，与WTS相比，转基因胚胎中49种蛋白质的丰度提高了，而165种蛋白质的丰度降低了。不出所料，丰度较低的蛋白质列表由液泡贮藏蛋白napin2，cruciferin1和cruciferin4占据，它们各自的丰度降低了5到10倍。这套减少丰度的蛋白质还包括参与三羧酸循环，糖酵解，氨基酸和多胺合成以及硫和辅因子（C1）代谢的几种酶。在上调的蛋白质中，最主要的是油质蛋白2，生物素羧基载体蛋白2（乙酰辅酶A羧化酶复合物的亚基）和质体丙酮酸激酶，所有这些都参与了蛋白质的合成。使用液相色谱/质谱平台对一组79种游离代谢产物进行定量。迄今为止，可溶性糖（尤其是蔗糖）是最丰富的代谢物类别，其次是氨基酸和有机酸（图7A）。值得注意的是，与WTS相比，转基因中氨基酸和多胺的含量几乎翻了一番。与WTS相比，转基因植物中的草酰乙酸（PEPC反应产物）显着增加了24％，除了这些变化之外，napin和十字花青素的损失引起细胞代谢其他中间体水平的微小变化（图7B）。

图7：甘蓝型油菜胚胎发育过程中代谢物的稳态分布及相关基因表达的变化

7. 胚泡和十字花青素的损失不影响胚胎的呼吸作用或光合作用。

由于发现转基因干预会改变种子组成和代谢特性（图1、5、7），因此代谢通量也应随之变化。胚干重（DW）组成数据用于甘蓝型油菜发育中的胚胎的代谢模型参数化。根据游离代谢物DW分数和组成数据（图7）在模型中定义了游离糖，氨基酸和其他极性代谢物的积累。通过通量平衡分析预测了两种基因型的代谢通量。基于生物合成途径通量，得出了脂质和蛋白质生物合成的能量辅因子需求（图8A）。在转基因品系中，该模型显示出生物合成的ATP需求量总体下降（图8A）。对蛋白质合成的ATP需求减少，而对脂质合成的ATP需求增加的幅度较小（图8A）。关于还原性辅因子的平衡，对转基因品系的总氧化还原需求增加，但是总体上氧化还原变化不如ATP需求变化明显（图8A）。由于观察到转基因胚的脂质在不饱和度方面总体上比WTS高，这可能意味着对减少脂肪酸去饱和当量的需求更高，并且对总氧化还原平衡产生了总体影响。如图8A所示，用于脂肪酸去饱和的氧化还原的平衡在转基因胚胎中增加了1.2倍。因此，降低脂质当量的总需求仅对降低当量的总体要求有轻微的影响。除了能量辅助因子的平衡外，我们还检查了胚的总氮平衡（图8B）。特别是，由于在转基因胚胎中发现PC增加了近5倍（图5A），因此有必要知道PC结合氮的相关增加是否对总氮平衡产生重大影响。

图8:RNAi转基因对甘蓝型油菜胚细胞影响的模型。

结论

本研究的一个突出结论是，抑制一类存储化合物（napin / cruciferin）的产生并不一定会导致同化物转向另一类（TAGs /种子油）。而通过抑制贮藏蛋白的积累来提高脂质或种子油的产量不太可能成功。目前的数据表明，仅提高油质蛋白的产量可能无法对种子脂质含量产生积极影响。在正常情况下，通过在背景中设计油质蛋白编码基因的上调，需要更严格地检验该结论。油质蛋白编码基因的上调与转录激活因子WRINKLED1，二酰基甘油酰基转移酶和其他脂质装配基因的增加相结合，为实际推动更高产油量提供了更好的机会。总体而言，本实验的结果支持为动物胚胎提出的定量合成模型。该模型预测，细胞器大小的确定取决于合成前体的数量。在目前的甘蓝型油菜转基因植物中，过量的油质蛋白和PC具有诱导形成大的含油质蛋白膜叠层的作用，该膜叠层替代了正常的蛋白质填充液泡，但未充满存储脂质。

评论

本文通过分析抑制编码蛋白质存储产物关键基因（napin，cruciferin）的作用，并且其在油菜中测试了蛋白质和油贮藏之间的权衡性。使用核磁共振和质谱成像、显微镜、转录组学、蛋白质组学、代谢组学、脂质组学、免疫学分析和通量平衡分析评估表型结果。意外的发现了在RNAi转基因中，存储产物的部分特征未发生显著变化。但是，胚胎细胞确有明显的结构重排现象。并且蛋白质平衡和氨基酸代谢是维持胚胎碳/氮稳态的代谢调节的重点。通量平衡分析表明，其对辅助因子（ATP，NADPH）的需求很小，因此，种子中的细胞可塑性可防止对其储存能力的干扰，从而为体内稳态做出重要贡献。这项研究提供了有关脂质和蛋白质存储之间的关系，旨在利用生物技术改善油料作物。

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