科研 | PLANT CELL: 大豆Dicer-Like2通过长反向重复序列产生主要22-nt小干扰RNA来调节种皮颜色
编译：Nicole，编辑：景行、江舜尧。
原创微文，欢迎转发转载。
在植物中22个核苷酸的小RNA（sRNA）触发次级小干扰RNA（siRNA）的产生并增强沉默。DICER-LIKE 2（DCL2）依赖的22-nt siRNA在拟南芥中很少见，被认为主要在病毒感染期间起作用。相比之下，这些siRNA在许多农作物中都很丰富，例如大豆和玉米。本文通过应用CRISPR-Cas9同时敲除天隆1号品种的大豆DCL2的两个副本GmDCL2a和GmDCL2b，研究了大豆22-nt siRNA。sRNA测序显示，大多数22-nt siRNA均来自长反向重复序列（LIR），而且在Gmdcl2a/2b双突中缺失。从头组装天隆1号参考基因组和转录组分析确定了查尔酮合酶（CHS）基因CHS1和CHS3形成的内含子LIR。此LIR是靶向其他CHS基因并触发次级21-nt siRNA产生的主要22-nt siRNA的来源。在Gmdcl2a/2b突变体中破坏此过程会大大增加种皮中CHS mRNA的水平，从而将种皮颜色从黄色变为棕色。本文结果表明，大豆中的内源性LIR转录本主要被GmDCL2加工成22 nt siRNA，并揭示了DCL2在调节自然性状中的作用。
论文ID
原名：Soybean Dicer-Like 2 Regulates Seed Coat Color via Production of Primary 22-nt Small Interfering RNAs from Long Inverted Repeats
译名：大豆Dicer-Like2通过长反向重复序列产生主要22-nt小干扰RNA来调节种皮颜色
期刊：PLANT CELL
IF：9.618
发表时间：2020年11月
通讯作者：翟继先、刘斌
通讯作者单位：南方科技大学、中国农业科学院作物科学研究所
DOI号：10.1105/tpc.20.00562
实验设计
结果
为了深入了解22-nt内源siRNA在大豆中的作用，将CRISPR-Cas9技术应用于大豆品种天隆1号中，以获得功能缺失的GmDCL2基因突变体。大豆基因组编码两个拷贝的DCL2：GmDCL2a（Glyma.09G025300）和GmDCL2b（Glyma.09G025400）；它们在编码的蛋白质序列中具有高度相似性（80.4％）。这两个基因在9号染色体上彼此相邻，表明它们是从最近的串联复制中衍生的，因此在功能上具有很高的冗余性。利用它们的高序列相似性，设计了单个gRNA同时靶向两个基因上的保守编码区（图1A），并通过组织培养进行了CRISPR-Cas9介导的基因编辑。
从多个独立的突变株中选择了三个纯合的双突变株Gmdcl2a/2b-8，Gmdcl2a/2b-9和Gmdcl2a/2b-16，以进行进一步研究（图1A）。所有这三行在目标位点周围都带有缺失，导致Gmdcl2a/2b的编码区发生移码和翻译终止（图1A）。突变株在植株结构上没有表现出明显的异常，只是略微矮小的。最显着的表型变化是，与野生型天隆1号的黄色种皮相比，所有三个品系的种皮均为棕色（图1B）。
2 DCL2功能丧失对大豆sRNA生物发生的影响
为了研究Gmdcl2a/2b功能丧失对sRNA生物发生和基因调控的影响，在野生型（天隆1号）和Gmdcl2a/2b中均进行了sRNA测序（sRNA-seq）和mRNA测序（mRNA-seq）。sRNA-seq结果表明，野生型大豆可产生大量的22-nt siRNA，在Gmdcl2a/2b突变体中其含量大幅下降（图2A）。
为了进一步分析这些依赖DCL2的siRNA，使用ShortStack根据每个簇中的优势大小类别对sRNA簇进行了分类。与先前研究一致，大豆中的大多数siRNA基因座都具有24 nt siRNA，但21和22 nt的基因座显示出更高的sRNA丰度（图2B）。在野生型中，从种皮中鉴定了1,304个22-nt siRNA基因座，从叶片样品中鉴定出1,371个，仅占基因座总数的约3％，但占总siRNA丰度的20％以上（图2B）。与野生型相比，来自22-nt siRNA基因座的siRNA在Gmdcl2a/2b突变体中显着降低（图2B、2C）。例如，超过70％的22-nt siRNA基因座在种皮中的丰度至少降低了10倍（图2D）。此外，突变体中某些21-nt siRNA基因座的siRNA，尤其是那些与22-nt siRNA基因座具有序列同源性的siRNA也有所减少（图2E），这表明依赖DCL2的22-nt sRNA能够靶向反式和触发21-nt siRNA的生物发生。这些结果表明，与拟南芥中低水平的22-nt siRNA相比，大豆积累了大量内源性22-nt siRNA，其生物发生需要DCL2。
研究者注意到Gmdcl2a/2b突变体中有少量22-nt siRNA基因座仍然很丰富，进一步的研究发现这些基因座表现出类似miRNA的特征。例如，一个基因座在网格蛋白基因（Glyma.14G058300）的第5个内含子中包含2个同源的Gypsy转座因子（TEs）；预计该基因座的RNA会形成类似于miRNA前体的带有凸起和错配的茎环样结构（图2F）。该基因座产生3种野生型的高度丰富的sRNA（在图2F中分别为sRNA-A、sRNA-B和sRNA-C）。尽管sRNA-B和sRNA-C在Gmdcl2a/2b突变体中几乎消失了，但是22-nt sRNA-A在Gmdcl2a/2b突变体中却更加丰富（图2F），这表明该茎环不仅由DCL2决定，也由其他DCL蛋白质决定，最有可能由DCL1决定。这一发现表明，依赖DCL2的22-nt siRNA有可能进化为依赖DCL1的22-nt miRNA，从而为通过DCL2进化22-nt miRNA的潜在途径提供了线索。
图2.在Gmdcl2a/2b突变体中22-nt siRNA的积累水平急剧下降。（A）siRNA在野生型（WT）和Gmdcl2a/2b突变体中的长度分布。（B）不同基因座的总基因座数量和siRNA积累的比例。（C）主要来自产生21-nt、22-nt或24-nt siRNA的基因座的sRNA的长度分布。（D）比较在野生型和Gmdcl2a/2b突变体种皮中22-nt siRNA位点的sRNA积累水平。箭头和圆圈标记了（F）中所示的miRNA样基因座。虚线表示sRNA的倍数变化为10。（E）比较在野生型和Gmdcl2a/2b突变体种皮中21-nt siRNA位点的sRNA积累水平。虚线表示sRNA的倍数变化为10。（F）miRNA样基因座。左图显示了潜在的miRNA / miRNA*对及其在野生型Gmdcl2a/2b（dcl2）突变体中的表达水平。右图显示了种皮中独特定位的mRNA读数的深度和独特定位sRNA读数的积累水平。
3 大豆中依赖DCL2的22-nt siRNA靶向大量转座因子
与拟南芥相比，大豆中的22-nt siRNA基因座除了数量相对较多外，还有另一个不寻常的特征：这些22-nt siRNA基因座中约有70％与转座因子（TEs）重叠（图3A），暗示其在TE沉默中的潜在作用。尤其是，来自Caulimovirus类TE的siRNA并非典型的24nt长度，而是22nt。本文发现其他TE家族（例如CMC-EnSpm）也产生了大量22-nt siRNA（图3B）,这些TE衍生的22-nt siRNA大多是链特异性的，并且在Gmdcl2a/2b突变体中其丰度急剧下降，例如花椰菜花叶病毒TE基因座和CMC-EnSpm基因座（图3B，3C）。除22-nt基因座外，本文还鉴定了数十个与TE相关的高度丰富的21-nt基因座，并且在Gmdcl2a/2b突变体中它们的sRNA积累也降低了（图3D），例如CMC-EnSpm位点，与产生TE的CMC-EnSpm家族的其他22-nt siRNA同源（图3C）。这些发现与以下假设相符：22-nt TE衍生的siRNA可能靶向同源TE转录本，并触发次级21-nt siRNA的产生以增强其沉默。但是，在Gmdcl2a/2b突变体中，本文没有观察到TE mRNA积累水平升高（图3D），这表明在大豆中存在其他抑制TE活性的冗余机制。本文测试了TE衍生的DCL2依赖性22-nt siRNA是否能够触发DNA甲基化，结果显示野生型和Gmdcl2a/2b突变体之间在这些22 nt TE位点的甲基化水平相似。
图3.种皮中TE衍生的22-nt siRNA。（A）21-nt、22-nt和24-nt siRNA基因座的TE富集分析。（B）来源于不同TE家族的sRNA的长度分布。（C）22-nt TE siRNA基因座（与TE重叠的siRNA基因座）和21-nt TE siRNA基因座的例子。（D）与WT相比，Gmdcl2a/2b突变体中sRNA的log2倍变化和TE siRNA基因座的mRNA积累水平。
4 GmDCL2倾向于以长反向重复序列（LIR）作为其底物
接下来，知道RNA二级结构是至少DCL1加工的关键特征，本文研究了22-nt siRNA基因座的结构特征。发现与21或24 nt位点相比，反向重复序列（IR）在22 nt位点的富集比例更高。例如，约80％的sRNA积累水平高于50 TPM的22-nt siRNA基因座与IR重叠，相比之下，只有12％的具有相似丰度的21-nt siRNA基因座与IR重叠（图4A）。mRNA-seq数据进一步表明，对于那些与22-nt siRNA位点重叠且具有相对较高sRNA积累水平（高于10TPM）的IR，其中90％被Pol II转录（图4B）。相比之下，与24 nt siRNA基因座重叠的IR几乎没有可检测到的polyA信号（图4B），因为大多数24 nt siRNA均来自不具有polyA尾巴的Pol IV转录本。本文还发现，较少数量的IR主要产生21-nt siRNA，并且也被Pol II转录（图4A、4B）。
先前的研究表明DCL4更喜欢长度超过100nt的双链RNA（dsRNA）底物，然而对于DCL2的底物偏好仍然未知。本文的分析发现，产生22-nt siRNA的IR的中位长度比产生21-nt siRNA的IR的中位长度长得多，尤其是对于高sRNA丰度的基因座。对于那些TPM高于50的基因座，产生21和22 nt siRNA的IR的中位长度分别为254 nt和1289 nt（图4C）。例如，基因Glyma.15G177500的第八个内含子包含一个由Copia TEs组成的长IR。该IR的重复区约为2800nt，并仅以有义链以DCL2依赖性方式产生大量22nt的siRNA（图4D）。相反，基因Glyma.14G055600的pre-mRNA包含一个短IR，其重复区为240 nt，并产生了一系列21 nt正义siRNA，不受Gmdcl2a/2b突变的影响（图4D）。这些结果表明，由Pol-II转录的长IR优先被大豆中的DCL2处理。相反，DCL4支持较短的IR（通常为300 nt和更短），以产生21 nt的siRNA。
图4. 反向重复衍生的22-nt siRNA。（A）种皮样品中21-nt、22-nt和24-nt siRNA基因座的IR富集分析。（B、C）种皮样品中与21-nt、22-nt和24-nt siRNA重叠的IR重复区域的RNA表达水平（FPKM）（B）和重复长度（C）。（D）种皮样品中22-nt siRNA基因座和21-nt siRNA基因座的例子。
5 DCL2依赖性22-nt siRNA调节大豆的种皮颜色
CHS是生物合成类黄酮的关键酶，类黄酮在大豆种皮中引起黑色/棕色色素沉着。野生大豆种质具有黑色或棕色种皮，而商业大豆品种由于I位点的显性等位基因的存在而呈黄色。I位点有四种基因型（I、ii、ik、i）。ii等位基因包含两个相似的反向重复簇，每个簇包含三个CHS基因（CHS1、CHS3和CHS4）（如图5A所示）。该基因座是siRNA的来源，siRNA靶向并沉默基因组中的其他CHS基因，并导致黄色种皮。
比较基因组分析发现，大多数品种（例如Wm82和ZH13）在CHS基因簇附近发生复杂的倒置和基因复制事件，导致枯草杆菌蛋白酶基因的启动子以及前四个外显子/内含子插入上游CHS基因簇的序列（如图5A所示）。也就是说由枯草杆菌蛋白酶基因启动子驱动的CHS1反义转录物可以与其他CHS1有义转录物碱基配对以形成dsRNA，然后将其进一步加工成21-nt siRNA以沉默其他CHS基因。最近的研究发现，AGO5参与了这个过程。由于大多数CHS siRNA是21-聚体，因此DCL2并未参与该调控机制。然而，本文显示由于Gmdcl2a/2b突变改变了天隆1号的种皮颜色，表明需要DCL2来维持CHS基因家族的沉默。
为了了解DCL2在调节种皮颜色中的作用，本文在天隆1号（ii等位基因，黄色种皮、浅棕色种脐）中组装了I基因座。本文发现，天隆1号中的I位点与枯草杆菌蛋白酶基因片段具有相同的倒置和重复，与先前在其他品种中显示的一样（图5A）。本文假设该枯草杆菌蛋白酶基因启动子可能驱动天隆1号中CHS1的反义链和CHS3的有义链的转录（图5A）。该嵌合转录本先前已在Williams 82品种的ESTs中表达并得到证实。枯草杆菌蛋白酶-反义-CHS1-有义-CHS3嵌合转录物中的反义CHS1区和有义CHS3区可以形成长的反向重复序列（LIR），因为CHS1和CHS3之间的序列相似。与本文的发现GmDCL2倾向于LIRs作为底物相一致，本文从反义CHS1区和有义CHS3区中检测到了一系列siRNA，它们在野生型中主要为22 nt（图5A、5B），并在Gmdcl2a/2b突变体中缺失（图5A、5C）。
除了CHS1和CHS3，本文还从其他CHS基因（例如CHS2、CHS7和CHS8）中检测到大量次级siRNA（图5B）。这些siRNA的长度主要为21-nt，由有义链和反义链产生（图5B），暗示RNA依赖性RNA聚合酶（RDR）可能参与了dsRNA前体的产生。有趣的是，这些21-nt siRNA也消失在Gmdcl2a/b dcl2突变体中（图5C），表明它们很可能是依赖DCL2的22-nt CHS siRNA触发的次生siRNA（图5D）。这与先前的研究调查了种皮发育的十个不同阶段的sRNA谱图相一致，并且发现在种皮发育的早期，22-nt CHS siRNA比21-nt siRNA更为普遍，包括4到开花后24天，而21 nt CHS siRNA在种皮发育的后期占主导地位。从CHS1/3（I位点）的22-nt siRNA过渡到CHS7/8处的主要21-nt次级siRNA的转变可能发生在5-6 mg阶段。在Gmdcl2a / dcl2b突变体中，与野生型相比，CHS2、CHS7和CSH8基因的mRNA积累水平高得多（图5C），种皮颜色从黄色变为棕色（图1B）。本文的结果表明，需要DCL2依赖性22-nt siRNA来维持CHS基因家族的沉默并调节大豆种皮的颜色（图5D）。此外，通过比较WT和Gmdcl2a/2ab突变体的mRNA-seq数据，本文确定了381个差异累积在叶片中的基因和1912个种皮（包括多个CHS家族成员），表明依赖GmDCL2的22-nt siRNA可以调节CHS家族以外的基因的表达。
图5. 22-nt siRNA抑制控制种皮颜色的CHS基因的表达。（A）野生大豆W05、栽培大豆ZH13和天隆1号基因组中I基因座的基因结构。（B））野生型CHS siRNA的长度分布。（C）Gmdcl2a / dcl2b突变体和野生型中CHS基因的sRNA和mRNA积累水平。（D）调节CHS基因表达水平的依赖DCL2的22-nt siRNA模型。
讨论
本文的结果表明DCL2可以作用于包含I位点（天隆1号栽培种的ii等位基因）中长CHS反向重复序列的转录本，但仍需要进一步试验证据。此外，一些证据表明，CHS dsRNA和CHS siRNA的生产调控更为复杂。根据最近的大豆全基因组分析，在24个现代品种中，有7个具有CHS排列的单倍型2，在I位点没有枯草杆菌蛋白酶的部分片段，但仍然有黄色种皮；此外尽管野生物种W05缺少部分枯草杆菌蛋白酶启动子片段并具有黑色种皮，但尚不清楚其他修饰因子（例如DCL2、AGO5或沉默途径中涉及的其他基因）的潜在突变是否会导致无法在W05中产生CHS siRNA；重新排列的枯草杆菌蛋白酶启动子假说不能解释在ii和ik等位基因中观察到的双色模式，因为沉默（黄色）和非沉默（色素沉着）区域都应具有相同的基因组结构。因此，未来研究这种复杂基因座在各种野生和栽培大豆中的机制最好使用具有遗传背景密切相关的系统研究。
大豆中22-nt siRNA的前体在许多方面类似于microRNA的前体：由Pol II转录的单链RNA，形成发夹状结构，并且不需要RDR的活性。在某些单子叶植物物种中，包括芦笋（Asparagus officinalis）、百合（Lilium maculatum）和黄花菜（Hemerocallis lilioasphodelus），也已观察到此类类型的siRNA的IR前体的24 nt phasiRNAs。此外，大豆中的22-nt siRNA也可以触发21-nt siRNA的产生，这与拟南芥最新报道一致。22-nt miRNA和LIR衍生的22-nt siRNA之间的前体结构和功能模式的相似之处暗示了22-nt miRNA从22-nt siRNA直接进化而来的潜在机制。本文的发现也支持先前提出的模型，即miRNA前体可源自形成反向重复结构的局部复制。因此，在大豆中产生22-nt siRNA的大量LIR基因座可为miRNA起源提供丰富的基础。
尽管野生型拟南芥几乎不产生22-nt siRNA，但本文发现大量22-nt siRNA来自大豆的LIR区，能够触发次级21-nt siRNA的产生，以进一步沉默TE或蛋白质编码基因。最近对来自47种不同植物物种的sRNA的研究表明，与拟南芥相比，许多主要农作物和蔬菜产生的22nt siRNA的水平要高得多。本文在这里的结果表明，依赖DCL2的22-nt siRNA能够调节自然性状，未来在更多物种中的研究可能有助于扩大对22-nt siRNA在野生型植物中可能未被充分认识的功能的了解。
更多推荐
1 科研 | PLANT CELL：导入蛋白及其两种拮抗物质对根分生组织中PLETHORA1的转录调控（国人佳作）
END