背景：全基因组分析造血细胞中的DNA甲基化：WGBS的DNA甲基化分析

全基因组分析造血细胞中的DNA甲基化：WGBS的DNA甲基化分析

First Online: 23 July 2017

译者注意：文章感觉什么都没说，也就是讲一下背景，测序中的步骤，可以了解一下，中间经过了什么处理。

介绍

DNA甲基化是一种经过充分研究，可遗传和可逆的表观遗传修饰，对多种细胞过程至关重要。具体地，DNA甲基化通过酶促机制实现，其中甲基被添加到胞嘧啶的五个位置，通常在CpG二核苷酸的情况下（图1a）。 CpG几乎总是甲基化，除非CpG处于高密度时，在这种情况下甲基化倾向于更低或完全不存在。虽然甲基化模式在细胞类型中相当稳定，但基因组的一些区域（例如增强子）在不同细胞和组织类型之间的甲基化水平是可变的。异常的DNA甲基化模式与许多人类疾病相关，例如癌症和神经发育疾病。虽然启动子和增强子中的DNA甲基化通常与基因表达的抑制相关，但基因体中的DNA甲基化与活性转录正相关。全面的全基因组DNA甲基化图谱可以揭示DNA在正常发育和疾病中的作用。因此，DNA甲基化的全基因组作图对于表观遗传学研究具有重要意义。

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图。1:（a）通过DNA甲基转移酶将胞嘧啶甲基化为5-甲基胞嘧啶。 （b）通过亚硫酸氢钠转化使胞嘧啶脱氨基。 未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶。 （c）亚硫酸氢盐转化和PCR扩增后的DNA序列。 未甲基化的胞嘧啶将被检测为胸腺嘧啶

DNA甲基化： mc --- C C --- T

​ 高通量测序技术的发展促进了DNA甲基化的全基因组测量。 目前，有三种主要测定类型的方法用于研究DNA甲基化[1]。 基于亚硫酸氢盐转化的方法，如全基因组亚硫酸氢盐测序（WGBS）[2,3]和还原代表亚硫酸氢盐测序，（RRBS）是目前最标准的方法[4,5]，但甲基化arrays 和亲和捕获方法是 也用于测定甲基化差异，特别是在人类细胞中。

​ 在亚硫酸氢盐测序方法中，亚硫酸氢钠用于将胞嘧啶转化为尿嘧啶（图1b），然后在随后的PCR和测序中将其检测为胸腺嘧啶[6]。 相反，甲基化胞嘧啶和羟甲基化胞嘧啶未经修饰而在DNA测序过程中被鉴定为胞嘧啶（图1c）。 亚硫酸氢盐转化方法已成为以单核苷酸分辨率检测全基因组DNA甲基化差异的非常有效的方法。

​ 基于亲和捕获的方法，如甲基化DNA免疫沉淀测序（MeDIP-seq）[7,8]和羟甲基化DNA免疫沉淀测序（hMeDIP-seq）[9]，分别使用识别甲基胞嘧啶和羟甲基胞嘧啶的抗体来降低甲基化 和羟甲基化的基因组区域。 Cytosine 5-亚甲基磺酸盐测序（CMS-seq）利用硫酸氢盐转化和亲和捕获方法进行5hmC检测[10]使用CMS特异性抗血清。 最后一种方法利用基于富集的方法，如甲基化敏感的限制酶消化测序（MRE-seq）[11]。

WGBS/RRBS
甲基化DNA免疫沉淀测序（MeDIP-seq）、羟甲基化DNA免疫沉淀测序（hMeDIP-seq）
甲基化芯片

Cytosine 5-亚甲基磺酸盐测序（CMS-seq）
甲基化敏感的限制酶消化测序（MRE-seq）

​ 虽然我们将重点放在样品制备上（图2），但也应考虑测序深度，因为这是该过程总成本的重要因素。 我们建议最低平均覆盖率为10-15倍。 这转换为使用当前Illumina HiSeq protocols的大约2亿次读取。 然而，更高的覆盖率可以获得更好的分辨率和检测次要甲基化差异的能力。

最低平均覆盖率为10-15倍 大约2亿次读取
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图2：WGBS protocol 概述。 分离的基因组DNA被片段化，平均大小为350bp。 将3'和5'突出端修复成钝端，并在钝片段的3'末端添加单个“A”。 A尾加工后，将甲基化的adapters连接到A尾片段上，并用亚硫酸氢钠处理。 进行最终扩增PCR并检查文库质量。

​ 最后，发现5-羟甲基胞嘧啶（5hmC）作为一种具有5mC潜在不同性质的DNA甲基化，增加了对该标记检测的兴趣。 重要的是，亚硫酸氢盐测序方法不能区分5mC和5hmC，因为用任一标记修饰的胞嘧啶都不受亚硫酸氢盐的影响。 因此，生物信息学分析和解释必须考虑到这一点。 如果需要，可以使用替代方法如氧化亚硫酸氢盐测序（OxBS-seq）[12]或Tet辅助亚硫酸氢盐测序（TAB-seq）[13]来检测5hmC。

5hmc：羟甲基化（5-羟甲基胞嘧啶（5hmC））
5mC：

# 背景
亚硫酸氢盐测序方法不能区分5mC和5hmC，因为用任一标记修饰的胞嘧啶都不受亚硫酸氢盐的影响。

# 检测5hmc方法：
氧化亚硫酸氢盐测序（OxBS-seq）或Tet辅助亚硫酸氢盐测序（TAB-seq）

2 Materials

2.1 Reagents

  1. PureLink Genomic DNA Mini Kit (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA).
  2. Quant-iT dsDNA Assay Kit, high sensitive (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA).
  3. Snap-Cap MicroTUBE vials (Covaris, Woburn, MA, USA).
  4. 4–20% Criterion™ TBE Gel (Bio-Rad, Hercules, CA, USA).
  5. Low-binding DNAse-/RNAse-free microtubes (Ambion, Waltham, MA, USA).
  6. TBE buffer, 10×, Molecular Biology Grade (Promega, Madison, WI, USA).
  7. Sybr Gold (Invitrogen, Waltham, MA, USA).
  8. TruSeq Nano DNA Sample Prep Kit (Illumina, San Diego, CA, USA).
  9. EpiTect Bisulfite Kit (Qiagen, Hilden, Germany).
  10. AMPure XP beads (Beckman Coulter, Brea, CA, USA).
  11. PfuTurbo Cx hotstart DNA polymerase (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA).
  12. 100 mM dNTP mix (25 mM of each dNTP; Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA).
  13. EvaGreen (Biotium, Fremont, CA, USA).
  14. 100% ethanol.
  15. 10× PBS (GenDepot, Katy, TX, USA).
  16. Ultrapure DNAse-/RNAse-free water (Thermo Fisher, Waltham, MA, USA)
  17. 100 bp DNA Ladder (GenDepot, Katy, TX, USA).
  18. 6× DNA loading dye (Promega, Madison, WI, USA).
  19. High Sensitivity DNA Kit (Agilent, Santa Clara, CA, USA).

2.2 Equipment

  1. Covaris S2 system (Covaris, Woburn, MA, USA).
  2. MicroTube holder (Covaris, Woburn, MA, USA).
  3. Dark Reader transilluminator (Clare Chemical Research, Dolores, CO, USA).
  4. Qubitfluorometer (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA).
  5. DynaMag-2 magnet (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA).
  6. Bio-Rad Thermal cycler (Bio-Rad, CFX96 Touch, Hercules, CA, USA).
  7. Real-time PCR cycler (Bio-Rad, C1000, Hercules, CA, USA).
  8. Criterion cell system (Bio-Rad, Hercules, CA, USA).
  9. Heat blocks.
  10. Vortex mixer.
  11. Bioanalyzer (Santa Clara, CA, USA).
  12. Illumina HiSeq 2500 (San Diego, CA, USA).

3方法

3.1基因组DNA分离

3.2 DNA片段化和清除片段化DNA

3.3末端修复，Poly-a尾和接头连接（Illumina Nano DNA样品制备试剂盒）

  1. 在最高60μL体积中使用100 ng-1μg片段化DNA。添加重悬浮缓冲液使总体积达到60μL。

  2. 加入40μL末端修复混合物，总体积为100μL，通过移液整个体积10次混匀，并全速离心30秒。

  3. 在30°C孵育30分钟，然后将样品置于冰上（见注6）。

  4. 从试剂盒中涡旋样品纯化珠粒以确保均匀分布。使用前将珠子温热至室温。

  5. 在65μL无核酸酶水中稀释95μL样品纯化珠。

  6. 将160μL稀释的样品纯化珠加入末端修复反应混合物中。移取整个体积十次并在室温下孵育5分钟。

  7. 将管放在磁力架上5分钟。

  8. 将250μL含有目标DNA的上清液从每个管中转移到新的PCR管中。丢弃含有珠子的管子。

  9. 涡旋样品纯化珠至少1分钟。将30μL室温未稀释的样品纯化珠加入含有250μL上清液的每个样品中。移取整个体积十次。

  10. 在室温下孵育5分钟。

  11. 将样品置于室温下的磁架上5分钟或直至液体澄清。

  12. 小心地从管中取出并丢弃所有上清液，不要打扰珠子。

  13. 在磁架上放置管子，用200μL新制的80％EtOH冲洗两次。

  14. 将磁珠颗粒在磁力架上风干5分钟。

  15. 用20μL重悬浮缓冲液重悬珠子，并通过移液整个体积十次充分混合。在室温下孵育2分钟。

  16. 将管放在磁架上5分钟。

  17. 将17.5μL澄清的上清液转移到新的PCR管中。

  18. 将12.5μLA尾加入混合物加入到17.5μL上清液中，并将整个体积的反应混合物移液十次。

  19. 在37°C孵育30分钟，在70°C孵育5分钟，并保持在4°C（见注7）。

  20. 当热循环仪温度在4°C下保持5分钟时，从中取出管子。短暂离心并保持在冰上然后进行下一个连接步骤。

  21. 向反应混合物中加入2.5μL重悬浮缓冲液，2.5μL连接混合物和2.5μLDNA衔接子指数。

  22. 移取整个体积十次并短暂离心。

  23. 在30°C孵育10分钟，然后置于冰上。

  24. 向混合物中加入5μL终止连接缓冲液并用移液管混合。

  25. 加入42.5μL充分混合的样品纯化珠，移液10次，在室温下孵育5分钟。

  26. 将管放在磁架上5分钟。

  27. 小心取出并丢弃80μL上清液，不要打扰珠子。

  28. 用200μL新鲜制备的80％乙醇洗涤珠子两次。在室温下风干5分钟。

  29. 从磁架上取下管子，通过移液十次将珠子重新悬浮在52.5μL的重悬浮缓冲液中。在室温下孵育2分钟。

  30. 在室温下将管放在磁架上5分钟。

  31. 将50μL上清液转移到新的PCR管中。

  32. 加入50μL充分混合的样品纯化珠，移液10次，在室温下孵育5分钟。

  33. 小心取出并丢弃100μL上清液，不要打扰珠子。

  34. 用200μL新鲜制备的80％乙醇洗涤珠子两次。在室温下风干5分钟。

  35. 从磁架上取下管子，通过移液十次将珠子重新悬浮在27.5μL重悬浮缓冲液中。在室温下孵育2分钟。

  36. 在室温下将管放在磁架上5分钟。

  37. 将25μL上清液转移到新的PCR管中。

  38. 继续进行亚硫酸氢盐转化。

3.4亚硫酸氢盐转化

  1. 根据制造商的建议（EpiTect Bisulfite Kit，Qiagen）设置亚硫酸氢盐转化率。
    亚硫酸氢盐转化反应混合物：
  2. 根据制造商的建议进行亚硫酸氢盐转化，以避免模板降解和处理和净化过程中的DNA损失，同时实现DNA的高亚硫酸氢盐转化率。 连续两轮亚硫酸氢盐转化有助于达到≥99％的转化率。
  3. PCR conditions.
  4. ......

3.5 3.5文库PCR扩增和珠子纯化

Library PCR Amplification and Bead Purification

  1. 准备PCRmix
  2. 在实时PCR循环中扩增反应。
  3. 为了最小化PCR引起的偏差，监测扩增循环。 最佳PCR循环是扩增曲线的线性相的中点。 红线标记扩增曲线的线性相位的中点，并用于确定最佳扩增循环数（图3a，见注11）。
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图3：WGBS库QC。 （a）用荧光染料EvaGreen进行最终PCR扩增的实时分析实例。 使用CFX96 Touch实时PCR检测系统（Bio-Rad）获得结果。 （b）在生物分析仪（安捷伦）上分析的最终文库的大小分布示例

  1. PCR完成后，将每个反应组合并使用1×AMPure XP珠纯化PCR产物。

  2. 洗去20μL重悬浮缓冲液。

3.6 Library Quality Control

  1. 使用Qubit荧光计量化文库。 预期的DNA浓度为10-30 ng /μL。
  2. 使用Bioanalyzer High Sensitivity DNA Kit运行1μL最终文库，检查文库大小分布。 预期的平均分布大小为300-500 bp（图3b）。

4 注意

11.与其他方法相比，WGBS方法准确且可重复。偏差和测量误差的主要来源于不完全的亚硫酸氢盐转化和序列的甲基化与非甲基化形式的差异PCR效率。

等等

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