【LorMe周刊】益生菌通过信号干扰抑制病原菌
作者：张煜铃，南京农业大学硕士在读。主要研究青枯菌多态性与动态组控。
周刊主要展示LorMe团队成员优秀周报，每周定期为您奉上学术盛宴！本期周刊为您介绍芽孢杆菌通过产芬荠素干扰群体感应来抑制金黄色葡萄球菌的定殖 。原文来自于2018年发表在Nature上的文章《Pathogen elimination by probiotic Bacillus via signaling interference》。
导读
益生菌可以改善人体健康。食物中的益生菌能抵御病原菌的定殖和深度感染，其机制尚不清楚。金黄色葡萄球菌的定殖与群感效应有关，那么益生菌芽孢杆菌是否通过干扰群感效应来抑制金黄色葡萄球菌的定殖呢。本文作者通过大量研究发现芽孢杆菌能够产生一种干扰金黄色葡萄球菌群感效应的次级代谢产物——芬荠素。芬荠素（Fengycin）与群感效应分子自诱导肽（AIPs）结构相似，通过与AIP受体蛋白竞争性结合来阻断群感效应，进而抑制金黄色葡萄球菌的在宿主体内的定殖。
芽孢杆菌对金黄色葡萄球菌有抑制作用
研究人员在泰国农村招募了200名健康的志愿者进行研究（图1a），尽量减少食品消毒剂和抗生素对饮食和肠道微生物的影响。作者在粪便样品（25例）（图1b）和鼻腔（26例）（图1c）中均检测出数量相似的金黄色葡萄球菌（黄色），表明细菌在鼻腔和肠道定殖之间存在相关性。
随后，作者通过16S rRNA测序分析了肠道微生物的组成，结果显示在金黄色葡萄球菌携带者和非携带者的肠道微生物组成无显著差异。但在其中101个标本样品中检测出芽孢杆菌（绿色），特别是在芽孢杆菌存在的样品中，未检测出金黄色葡萄球菌（灰色）。此外，肠道中存在芽孢杆菌时，鼻腔中也未检测出葡萄球菌，说明芽孢杆菌对于葡萄球菌的抑制作用并不仅仅局限于相互作用的部位。
图1 人体中芽孢杆菌对金黄色葡萄球菌的清除
金黄色葡萄球菌的群感效应
Agr系统是金黄色葡萄球菌的群体感应系统，该系统与金黄色葡萄球菌的种系发育和其致病性密切相关。作者通过小鼠肠道定殖实验检测Agr系统是否影响金黄色葡萄球菌的定殖（图2a）。
在竞争实验中（图2b），分别给小鼠口服野生型（WT）金黄色葡萄球菌ST2196 F12和agr缺失突变体菌株（Δagr）后第2、4、6天和实验结束时，在粪便样品与肠道中没有检测到Δagr菌株，说明Agr系统与金黄色葡萄球菌在肠道中定殖有关。
在基因互补菌株的非竞争性实验中，作者分别给小鼠口服带有pKX∆16对照质粒的野生型菌株、agr突变体菌株以及含有pKX∆RNAIII的Δagr突变体菌株（Agr补充菌株）。结果显示，只有细胞内Agr效应子表达的RNAIII34的Δagr突变株才能在肠道定殖，而Agr阴性对照菌株则无法定殖于肠道（图2c）。
这些数据表明Agr系统能够影响金黄色葡萄球菌的定殖，并且只有该细菌在肠道中生长时Agr系统才会发挥作用。
图2 金黄色葡萄球菌肠道定殖的群体感应依赖性
芬荠素（Fengycin）--群体淬灭剂
作者从粪便样品中筛选出105株枯草芽孢杆菌，并使用了金黄色葡萄球菌报告菌株检测。研究发现所有菌株的无菌培养液均降低了金黄色葡萄球菌agr的表达（图3a），以及受Agr系统调控的蛋白，如酚溶性调节蛋白(PSMs）、α-毒素（α-toxin）和杀白细胞素（PVL）的产生（图3b，c）。
随后，作者通过反相高效色谱（RP-HPLC）和电喷雾电离质谱（ESI- MS）从枯草芽孢杆菌无菌培养液中分离鉴定出了芬荠素（图3d，e）。此外，在许多分离的枯草芽孢杆菌中中检测到β-OH-C17-fengycin B产量最高，当其浓度达到1.4 µM时， agr的活性几乎被完全抑制（图3d）。该结果与分离的枯草芽孢杆菌在固定相培养产生的总芬荠素的中值浓度（1.5 µM）相对应（图3e）。作者分别构建了ΔfenA（缺乏芬荠素合成基因）和ΔsrfA（缺乏表面活性素合成基因）两种突变体，同野生型（WT）相比，ΔfenA与ΔsrfA菌株的无菌培养液对agr活性无影响（图3f）。以上结果表明芬荠素能够抑制agr的表达。
图3 芽孢杆菌芬荠素对金黄色葡萄球菌群体感应的抑制
图4a为芬荠素抑制Agr系统的模型。Agr系统中P2启动子驱动agrBDCA操纵子编码自诱导肽（AIPs）的前体--AgrD，随后经过AgrB的修饰后形成AIPs，AIPs能够与细胞膜上的AgrC受体蛋白结合，并激活AgrC蛋白使其磷酸化。磷酸化后的AgrC进一步激活AgrA，AgrA的激活既可以上调其自身启动子P2，又可以上调启动子P3。P3操纵子负责编码RNAIII，并驱动其表达，从而调节靶细胞表达，例如编码ClfA，α-毒素和白细胞毒素的靶基因。
作者发现芬荠素的结构与AIPs结构相似（图4b），并且能够与AgrC酶结合，从而抑制AIPs与AgrC的结合。将缺失agrBD的金黄色葡萄球菌菌株加入含有芬荠素的枯草芽孢杆菌无菌培养液，结果表明Agr受到抑制，排除了抑制Agr的靶标位点是AgrB的可能（图4c）。实验通过添加外源AIPs，可以解除芬荠素抑制作用（图4d）。因此，芬荠素可以作为AIPs的结构类似物抑制Agr信号转导。研究发现β-OH-C17-fengycin B能够抑制几种不同的金黄色葡萄球菌菌株，说明芬荠素的抑制作用具有广谱性。
图4 芬荠素对金黄色葡萄球菌AIPs的竞争性抑制
为了验证这些发现，于第二、四、六天，分别给小鼠口服金黄色葡萄球菌ST2196 F12，随后在给小鼠喂食的饲料中分别添加芽孢杆菌野生型（WT）和fenA突变体（ΔfenA）的孢子来模拟益生菌的摄入。实验设置了使用抗生素和不使用抗生素作为预处理，结果显示，喂食野生型菌株孢子的小鼠肠道和粪便中均检测不到金黄色葡萄球菌（图5b，c）；相反，fenA突变体不影响金黄色葡萄球菌的定殖。
图5 芽孢杆菌产芬荠素对小鼠金黄色葡萄球菌定殖的抑制作用
总结
群感效应对于细菌的定殖至关重要。一方面，芽孢杆菌可以通过产AIPs类似物--芬荠素与受体蛋白结合，影响细菌的群感效应。另一方面，芽孢杆菌可以通过削弱和破坏金黄色葡萄球菌在肠道和鼻腔中的定殖来降低细菌感染的机率。因此，芬荠素可以作为一种群感效应抑制剂用于由金黄色葡萄球菌引起的感染的治疗。此外，群感效应抑制剂还可以减少细菌耐药性，有望代替抗生素成为治疗金黄色葡萄球菌感染的最佳选择。
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