RT-PCR技术原理和应用

RT-PCR将逆转录步骤和后续的PCR在一管内进行。RT-PCR逆转录步骤之后可以承接普通PCR、SYBR Green I法荧光定量PCR（RT-qPCR）和探针法荧光定量PCR（RT-qPCR）。

RT-PCR是将RNA的反转录(RT)和cDNA的聚合酶链式扩增(PCR)相结合的技术。首先经反转录酶的作用从RNA合成 cDNA，再以cDNA为模板，扩增合成目的片段。RT-PCR技术灵敏而且用途广泛，可用于检测细胞中基因表达水平，细胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列。作为模板的RNA可以是总RNA、mRNA或体外转录的RNA产物。无论使用何种RNA，关键是确保RNA中无RNA酶和基因组DNA的污染。

RT-PCR是将RNA的反转录(RT)和cDNA的聚合酶链式扩增(PCR)相结合的技术。首先经反转录酶的作用从RNA合成 cDNA，再以cDNA为模板，扩增合成目的片段。RT-PCR技术灵敏而且用途广泛，可用于检测细胞中基因表达水平，细胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列。作为模板的RNA可以是总RNA、mRNA或体外转录的RNA产物。。RT-PCR用于对表达信息进行检测或定量。另外，这项技术还可以用来检测基因表达差异或不必构建cDNA文库克隆cDNA。RT-PCR比其他包括Northern印迹、RNase保护分析、原位杂交及S1核酸酶分析在内的RNA分析技术，更灵敏，更易于操作。逆转录反应可以使用逆转录酶，以随机引物、oligo(dT)或基因特异性的引物(GSP)起始。RT-PCR可以一步法或两步法的形式进行。在两步法RT-PCR中，每一步都在最佳条件下进行。cDNA的合成首先在逆转录缓冲液中进行，然后取出1/10的反应产物进行PCR。在一步法RT-PCR中，逆转录和PCR在同时为逆转录和PCR优化的条件下，在一只管中顺次进行。

RT-PCR是检测RNA模板或基因表达水平最敏感的技术之一，一步法RT-PCR能克隆微量mRNA而不需要构建cDNA文库,即cDNA合成与PCR反应在同一buffer中进行，一步完成，省略了cDNA与PCR之间的过程。两步法RT-PCR：首先用反转录酶AMV、MULV或TthDNA聚合酶合成cDNA，然后以cDNA为模板进行PCR。RT-PCR一步法与RT-PCR两步法进行比较，显示RT-PCR一步法：快速、简便、敏感、减少污染机会，减少了mRNA二级结构。两步法：同一管中同时扩增两个引物，减少了一些人为的误差，将RNA转录为cDNA，易于保存。两步法的费用比一步法少。