重构人胚胎着床的单细胞转录组与DNA甲基化组图谱
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概 · 述
胚胎植入是哺乳动物胚胎发生过程的里程碑事件，植入失败是流产相当重要的因素之一。鉴于无法获取体内植入后胚胎，故而目前仍不了解胚胎植入这一过程的基因调控网络与表观机制。作者结合胚胎体外培养（自组装）与单细胞多组学测序，对来自围着床期65个胚胎共八千余个细胞进行了系统分析。对转录组数据进行无监督降维与聚类揭示了植入过程中的EPI、PE、TE的变化路径，它们为建立胚胎植入过程中的“母胎连接”（mother-to-offspring）提供了可靠且充分的准备。此外，该阶段雌雄胚胎的X染色体剂量并未平衡且雌性胚胎逐渐启动并呈现父源或母源X染色体随机失活趋势。
单细胞多组学分析发现，植入过程中 PE 细胞的再次甲基化要远迟于 EPI 与 TE 。这说明，即使PE与EPI皆由ICM而来，仍有截然不同的甲基化动态变化特征。
正文
人类胚胎由受精卵发育而来，经历由ICM与TE构成的早期囊胚而后着床。晚期ICM由EPI和PE组成，EPI覆于PE表层。EPI/PE/TE 分别发育为胚体、卵黄囊和胎盘。在E6-7时期，胚胎植入子宫形成原肠胚，随后形成器官。由于伦理问题，体内植入后胚胎目前并没有多少研究。本研究利用胚胎体外培养与单细胞多组学技术，在单细胞水平上分析了围着床期胚胎基因表达网络与各谱系DNA甲基化特征。
作者首先模拟了E14前的体外胚胎植入过程，对五个时期（E6/E8/E10/E12/E14）的胚胎进行了单细胞水平解析。
t-SNE结果显示细胞类型与各阶段胚胎相对应。
由于ysTE细胞过少，下一阶段不进行分析。下一阶段选取了3184个细胞进行后续分析。
作者随后对EPI/PE/TE细胞特异表达基因进行了分析。对EPI而言，除了一般性marker，它还表达KHDC3L, TDGF1, CXCL12 and THY1。这几个基因在猴胚胎植入阶段作为EPI marker已被报道。
免疫荧光结果显示， EPI marker OTX2 在部分表达GATA6的 PE细胞中表达而在表达OCT4 的EPI 中OTX2 不表达，这也印证了作者所测的单细胞结果。尽管人胚胎特异表达某一些基因，但人猴胚胎的三种细胞及其对应分化群的部分特征是相同的。
主成分分析和拟时分析显示，三种细胞存在着各自的发育轨迹，表明植入是一个渐进的过程。
对每种细胞进行阶段特异性表达模式分析显示，胚胎在植入过程中开始准备母胎连接，表达相应的基因。最为明确的证据是，在E12-14 期，TE形成了两个亚群，鉴定这一分群主要由HCGB家族基因差异表达引起的。作者确定了TE细胞群由细胞滋养细胞和合体滋养细胞组成。细胞滋养细胞也表达TE和胎盘的调控因子，如FABP5和FGFR1，而合胞滋养细胞表达胎盘的激素相关基因(如PSG3和PSG6)和一些新鉴定的基因(如TCL6和TBX3)。
此外，在胚胎植入过程中，减数分裂和有丝分裂衍生的拷贝数变异(CNVs)均广泛存在。在t-SNE图中非整倍型与整倍型细胞仍聚在一起，这说明胚胎植入早期的细胞谱系分化与CNV关系不大。
X染色体失活对于雌性(XX)和雄性(XY)之间X连锁基因的剂量平衡非常重要，X染色体上基因表达的上调是其主要指标。通过上调X染色体基因表达，X连锁基因的表达应与常染色体应当相同。对雄性细胞X染色体与常染色体基因表达分析发现其比值为2:2，表明 X染色体基因上调已经启动。雌性细胞这一比例略高于1. 因此作者推断E12时 ，X染色体失活与基因表达上调已经开始进行，但雌性细胞在此阶段略慢于雄性细胞；即其中一条X染色体随机失活而另一条X染色体基因表达上升接近2倍。
作者选取了238个单细胞进行全长cDNA测序，以此分离分析每个细胞中的亲本等位基因。
同时对亲代供体进行基因组测序查看单核苷酸多态性发现，在E6期，大多数细胞父系母系X连锁基因仍平衡表达，但在E8开始变化。这表明X染色体失活开始于植入早期阶段。
DNA甲基化在哺乳动物胚胎发育过程中有重要的表观调控作用，但围绕植入期的不同谱系细胞甲基化动态仍不清楚。采用scTrio-seq2 策略对另一批次的培养胚胎进行分析，收集了17个胚胎计2544个细胞用作后续谱系鉴定。随后收集了371个谱系特化细胞进行甲基化测序。此外还收集了130个整倍型细胞进行分析。对这130个细胞的甲基化数据进行pca聚类发现他们分为四群，其中一个群包括了囊胚阶段的EPI/PE/TE细胞，其他三个群为囊胚期后的各类细胞的单独成群。这表明植入后胚胎的甲基化水平发生了相当大的转变。
随后对每个谱系甲基化动态进行分析发现，在植入阶段，它们都经历了比较强的再次甲基化过程。
可以看到，EPI甲基化水平从 E6 的26.1% 猛增到E10 的60%，TE也发生了显著的增长；但是对PE 而言，E6 时甲基化水平与EPI 相当，但在E10 时较EPI 而言已经相当不及。尽管二者均来自ICM ，但是PE 再甲基化比EPI 要慢得多。
这些结果表明，胚胎在囊胚早期可能已经开始了再次甲基化进程，这三种细胞不仅有着不同的基因表达特征，还表现出明显不同的再次甲基化速率与模式。
三种细胞均有高甲基化 genebody与低甲基化启动子区，该特征与植入前胚胎状态类似。
对三种细胞基因组再次甲基化区域进行深入分析发现，DNA再次甲基化在胚胎植入过程中具有明显的基因组元件特异性和细胞谱系特异性特征。
作者发现241个基因启动子区域甲基化水平升高，这表示在植入过程中它们的表达可能会被抑制；
且每种细胞均有特异甲基化基因表达。对E8 期细胞分析发现，如Oct4和Nanog 二者在TE中被甲基化而在PE与EPI 中没有被甲基化；相反，分化（发育）marker 如MMP26, PSG7,ELF5 这三者启动子在EPI 和TE 中被甲基化而在TE中则是开放的；同样，PE marker 如 APOA1和 CPN1，二者在TE和EPI 中被甲基化而在PE 中正常。这些结果表明，DNA甲基化可能在调节不同细胞特异性基因的表达和维持不同细胞分化方向上发挥重要作用。
总结
作者在单细胞水平上建立了人胚胎植入期转录组与甲基化图谱，发现了胚胎植入关键的发育事件。虽然体内胚和模拟胚可能有很多潜在差异，但这个课题为将来研究模拟胚胎提供了一个基础。（然后是套话说研究定向诱导分化和精准医疗之类的东西）。
分析代码
https://github.com/WRui/Post_Implantation
数据位置
scRNA-seq
GSE109555
单细胞全基因组测序
EGAS00001003443，EBI上的。
其他数据
父源精子细胞和母源外周血测序：EGAS00001002987
结语
总的来看，这个研究结合了两大热点：体外胚胎合成与单细胞测序技术，研究了一般获取不到的围着床期胚胎发育事件，虽然模拟胚胎的与真实胚胎的差异有待商榷，但总体还是很有意思的。