荧光定量PCR技术在食品检测领域中应用

随着生活水平提高，人们对食品质量要求越来越高，而目前广泛应用物理、化学、仪器等检测食品方法，由于存在某些局限，已不能满足现代食品安全检测需要。随着生物技术发展，尤其是自从发明聚合酶链式反应（polymerasechainreaction，PCR）后，已成功利用PCR技术解决过去在食品中难于进行测定成分的检测。但传统 PCR技术应用仍有不足之处：一是不能准确定量；二是容易产生交叉污染、产生假阳性；三是普通PCR分析的都是终极产物。在多数情况下，所感兴趣的是未经PCR放大前起始模板量，在此种情况下应运而生荧光定量PCR技术。

实时荧光定量PCR（RQ–PCR）是在定性PCR技术基础之上发展起来的核酸定量技术，即在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析一种方法。该技术不仅实现对 DNA模板定量，且还具有灵敏度高、特异性和可靠性强、自动化程度高、污染性小、及实时性和准确性等特点，目前已广泛应用于食品各个领域。

荧光定量PCR技术原理

定量原理

PCR反应过程产生 DNA拷贝数，随反应循环数增加，以呈指数方式增加逐渐转入平台期。在传统PCR中，用终点法对PCR产物定量有不足之处；而RQ––PCR对整个PCR反应扩增过程进行实时检测，并连续分析与扩增相关荧光信号，随反应进行检测到荧光信号变化可绘成一条曲线。因此可在PCR反应处于指数期某一点检测PCR产物量，并由此推断模板最初含量。为方便对所检测样本进行比较，在RQ–PCR反应指数期，首先需设定一个荧光信号域值，这个阈值（threshold）一般是以PCR反应前15个循环荧光信号作为荧光本底信号。如检测到荧光信号超过此域值被认为是真正信号，它可用来定义样本域值循环数Ct（Ct含义：每个反应管内荧光信号达到设定域值时所经历循环数）。研究表明，每个模板Ct值与该模板起始拷贝数对数呈线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知拷贝数标准品可做出标准曲线，因此只要获得未知样品Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品起始拷贝数。

霍乱弧菌检测

霍乱弧菌检测一直是微生物检验工作一个难点，尤其是食品中霍乱弧菌检测，常常由于菌量少、菌株变异大及霍乱弧菌越冬机制不明瞭，使常规培养法、血清学检测法等无法检出。在研究霍乱弧菌不同血清型NhaA基因变异基础上，选取不同血清型间NhaA基因共有保守序列，建立荧光定量PCR检测方法，并比较其与常规检测方法在海产品霍乱弧菌检测上灵敏度和特异性。结果表明，荧光定量PCR与常规检测方法灵敏度、特异性一致；但在含菌量少、菌株易发生变异标本检测上，荧光定量PCR显示出其独特优越性。因其不仅提高常规检测方法灵敏度，且避免常规PCR方法由于后处理过程引起污染所带来假阳性，对食品，尤其是海产品霍乱弧菌检测有较大指导意义。

1.2实时定量PCR类型

实时定量PCR类型主要有探针类和非探针类两种。探针类是利用与靶序列特异杂交探针指示扩增产物增加，特异性高；而非探针类是利用染料或特殊设计引物指示扩增增加，特异性受到质疑，但其简便易行。近年来，又发展一些新的预防或识别非特异扩增的探针法，例如Amplisensor技术、分子信标（Molecularbeacon）、Lightcycler技术、复合探针法（Complexprobes）等。

其它致病菌检测

除上述病原微生物检测外，RQ–PCR技术还用于食品中其它多种致病菌检测。研究发现，将食品中致病菌传统检测方法是先采用非选择性和选择性增菌，然后进行分离培养、生化反应和血清学鉴定，检验程序十分繁琐；且肠杆菌科细菌间生化反应多有交叉，一般需4d——7d才能完成，因此传统检测方法在快速、敏感与特异性等方面都有自身局限免疫磁珠法与实时荧光定量PCR技术相结合，即可不经富集培养阶段便可准确、快速检测出大肠埃希氏菌O157：H7；Rueckert等   利用特异性16SrRNA引物部分基因片段定量检测出奶粉中嗜热细菌；用定量PCR检测出色拉中利斯特菌；建立奶粉中坂崎肠杆菌实时荧光PCR检验方法；建立食品中单增李氏菌实时荧光PCR检测鉴定方法。此外，还有将该技术应用到食品致病性蜡样芽孢杆菌、空肠弯曲菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球等检测报道。

沙门氏菌检测

随着分子生物学及分子细菌学发展，荧光定量PCR技术应用为致病菌检测提供一种新的手段。沙门氏菌所引起中毒在世界各地食物中毒病例所占比例非常高。有资料显示，我国 70%——80%细菌

菌性食物中毒事件系由沙门氏菌引起    。目前正

致病菌检测

在进行食品质量安全监控的中国计量认证（Chinametrologyaccreditation，CMA）检测时，对沙门氏菌检测已成为必检卫生指标之一。近年来 PCR技术用于检测食品中沙门氏菌方法有多种，如常规 PCR、套式PCR、多重PCR、荧光定量PCR等，这些方法各具其优缺点，其中荧光定量PCR因其不易污染、灵敏度高等优点，将会越来越广泛应用到食品沙门氏菌检测。Daum等建立利用荧光定量 PCR法从引起沙门氏菌食物中毒剩菜及病人粪便中检测沙门氏菌方法，且利用荧光TaqManPCR法在3小时内即可从鸡肉中检测出沙门氏菌，更证明荧光定量检测时效性。

食品转基因检测

当前，国际社会对转基因食品检测技术路线主要有两条：一是对外源基因表达产物蛋白质进行检测；二是直接检测外源基因DNA。随检测手段不断提高，对食品转基因检测已从定性提高到定量水平 。

对外源基因表达产物蛋白质检测常用方法有酶联免疫法（ELISA）、蛋白质印迹法（Westernblot）等，这些检测方法大多基于免疫反应高度特异性。

外源基因 DNA检测主要是以核酸为基础  PCR检测法，用PCR技术和核酸探针杂交检测技术准确快速检测外源基因，其敏感、快速、简便特点是其它检测技术所无法比拟的。而新近发展实时荧光定量PCR技术是集PCR和探针杂交技术优点为一体，可通过探测PCR过程中荧光信号变化，准确定量DNA模板量。其检测灵敏度比常规PCR技术高100倍左右，可检测到每克样品中含 2pg转基因DNA量；且对加工、加工和混合样品都可进行检测。

荧光定量PCR技术在食品检测领域中应用

副溶血性弧菌检测

副溶血性弧菌（Vibrioparahaemolyticus）主要分布于海水、海河交界处及海产品中，是沿海地区引起食物中毒重要病原菌。副溶血性弧菌在海产品中带菌率高达45.7%   ，其生长速度是一般细菌（如大肠杆菌、沙门氏菌等）两倍，因而更易于引起食物中毒。目前，对溶血性弧菌检测仍以传统培养法为主，实验操作繁琐，一般需费时5d——6d，因此影响食物中毒快速诊断和处理；且其检出率较低，给海产品生产、出入境检验检疫及食品卫生监督等带来困难。近年用PCR技术快速检测食品中副溶血弧菌文献也多有报道；但常规PCR有一定缺陷，例如扩增产物易受污染、出现假阳性结果等。为克服这些缺陷，焦红等建立用荧光定量PCR检测食品中副溶血弧菌方法。研究表明，该法具有良好特异性和灵敏度，与传统检测法相比，大大提高检测效率；且操作简便快速、检验周期短，所以其在食品副溶血弧菌检测中将有很好应用前景。

近年有许多利用RT–PCR技术检测转基因食品文献报道，采用实时荧光定量PCR技术，通过使用特异引物和探针，对玉米中内源基因lnvertase、转基因玉米 Mon810、Event176外源基因进行定量检测，由此建立商业化转基因玉米Mon810（YieldGard）和Event176（Maximizer）定量PCR检测方法。该法检测灵敏度可达 0.01%，是国际上设定转基因最低限量100倍。研究表明，荧光定量PCR法可检测出包括豆腐等在内豆制品中转基因成份含

量；邓鸿铃   等针对食用油脂中DNA含量极低、DNA序列片段短、破坏严重等特点，建立食用油脂DNA提取方法，通过实时荧光PCR检测出大豆内源基因（Lectin）及外源抗除草剂基因，为食用油脂进行核酸类生物性检测提供一种快捷有效方法。

结束语

实时荧光PCR技术能有效解决传统定量中只能终点检测局限，同时由于采用闭管分析，且无需电泳等PCR后处理步骤，所以能有效减少核酸扩增产物交叉污染，更避免电泳染色剂EB或用于标记目的产物放射性同位素对研究人员伤害。因此将实时荧光定量PCR技术应用到食品致病菌检测，既克服传统致病菌检测方法在快速、敏感与特异性等方面局限，又大大缩短检测时间、提高检测灵敏性和特异性，为今后提高食品微生物检验时效性提供很大发展空间。转基因食品是近20年随基因工程技术发展而产生新兴食品，近年发展更为迅速，已走进寻常百姓餐桌，因此其安全性问题也成为公众注意焦点。一种敏感、快速、准确转基因食品定性及定量检测方法已成为需亟待解决问题，而荧光定量PCR技术迅速发展及其应用推广已基本上解决这一难题。但实时荧光PCR技术也有不足之处，例如随越来越多目的基因被导入更多食品作物中及越来越多转基因生物采用全新启动子、终止子和标记基因，因而再用荧光定量PCR检测常用筛选因子就会有一定局限性。若将该技术与其它诸如生物芯片、免疫磁珠、色谱技术、光谱技术等联合使用，必将在食品安全检测领域开辟一个新的应用时代。