文末福利丨关于液相色谱峰的拖尾问题

文末有福利,不要错过喔!
同学们如果仔细查看色谱图,就会发现几乎每一个色谱峰都有一定程度的拖尾现象
这本不是问题,但是当拖尾严重到一定程度就会影响我们的分析结果,所以今天就让我们来谈一谈关于液相色谱峰的拖尾问题吧!
什么是拖尾峰
前沿陡峭,后沿较前沿平缓的不对称峰,称为拖尾峰
下图就是一个拖尾峰,我们会发现这个峰的右半边峰宽是大于左半边峰宽的,尤其在基线处更加明显。
那如何评价色谱峰的拖尾呢?
绝大多数情况下制药行业的从业人员会选择用美国药典(USP)中拖尾因子(Tf)来评价,而其余的分析行业内人员则会选择用对称因子(As)来评价。
关于这两个因子的计算,我们之前就有相关的视频介绍,大家可以回顾一下:
拖尾因子和对称因子到底什么关系?

其中,拖尾因子Tf=(a+b)/2a,a和b分别是5%峰高处的左右半峰宽。

对称因子As=d/c,其中c和d分别是10%峰高处的左右半峰宽 。
如果a=b,c=d,那么拖尾因子和对称因子的数值都等于1,也就是该峰不拖尾。
实际工作中,当拖尾因子和对称因子小于2时,这两个值是非常接近的,如下图所示。
拖尾峰
会对工作造成什么影响
1
影响峰高的计算
先来看看第一个峰(Tf=1.0)和最后一个峰(Tf=3.5),它们的峰面积虽然是相同的,但是由于最后一个峰拖尾很严重,所以它们的峰高相差三倍。
当我们使用峰高来计算最低检出限时,拖尾峰的负面影响就会比较明显。
2
影响峰面积的计算
当我们对色谱峰进行积分来计算峰面积时,峰的起点和终点通常情况下通过色谱峰的斜率来确定。
色谱峰越拖尾,它的尾部基线越平缓,终点就越难确认。
这一点在基线波动较大时体现的更加突出,那么它就会影响我们积分得到的峰面积。
3
影响对某些痕量组分的确认
在药典计算有关物质的相关要求中会提到,峰面积达到主峰面积0.1%的组分都要参与计算。
那么当一些小峰和前面的峰分离度不是很好时,就会容易被隐藏在前面峰的拖尾处从而无法参与计算。
综上所述,拖尾峰会对色谱分析的定性定量结果都会产生影响。
产生拖尾峰的原因是什么

01

拖尾峰的形成是因为在色谱分离时出现了一种以上的保留机制,并且其中一种保留机制是超负荷的。
在日常分析中大多数情况下会使用反相色谱,以常用的C18柱为例,C18是被键合在载体硅胶表面的,而硅胶是由硅和氧聚合而成的,所以它的表面会出现各种形态的硅羟基。
虽然理想的状态是流动相中的样品只和固定相C18发生作用。而实际上一半以上的硅胶表面并没有被键合上C18,所以硅胶表面会裸露出大量的硅羟基(Si-OH)。
而单独的自由硅羟基会和流动相中的样品发生作用,形成拖尾。
于是在最近的十几年中,色谱柱供应商致力于生产出高纯度的硅胶载体。由于新型硅胶在无金属离子环境下制造,所以表面不会残留金属离子也会减少拖尾。
另外,硅胶表面尽可能减少自由的硅羟基,未与固定相键合的硅羟基尽可能形成螯合或聚合状态,用来减少拖尾峰的产生。

02

当色谱柱经历过高温、强酸,或者一些极端使用方法导致固定相流失较多后,色谱柱中的自由硅羟基也会变得越来越多,从而更加容易造成拖尾峰

03

拖尾峰的形成也有可能是因为柱外的死体积较多,导致样品在死体积处发生了滞留和扩散。

04

当样品中出现了碱性化合物,碱性基团更容易与色谱柱中硅羟基发生作用形成拖尾峰。
如何改善拖尾峰

01

对于过去的自由硅羟基较多的色谱柱,建议在流动相中加入三乙胺来抑制拖尾。实验表明三乙胺有非常好的拖尾抑制效果。
另外,由于三乙胺呈碱性,需要大家在使用时考虑色谱柱的ph值耐受范围,某些情况可能需要加入酸性调节剂。
对于新型的表面以耦合和聚合硅胶为主的硅胶载体,我们就很少使用三乙胺来抑制拖尾,而是通过调整流动相的ph<3来抑制硅胶的离子化。

02

当色谱柱柱效降低导致拖尾峰时建议更换色谱柱。

03

建议在液相色谱中正确安装并且使用与您的仪器匹配的管线接头,以减少死体积的产生。
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同学们,今天的拖尾峰相关问题不知大家还有没有更多的理解和建议呢?欢迎大家踊跃留言哦~

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