科研 | Nature：肠腺窝中代谢物的相互影响维持干细胞功能
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小肠上皮细胞每隔4、5天会进行自我更新，肠干细胞（Lgr5+CBC）维持着这种自我更新，并且位于末端分化的潘氏细胞（Paneth cells）之间、肠腺窝的底部。虽然维持干细胞功能和腺窝内稳态的信号需求已经被透彻研究，但新陈代谢如何控制上皮细胞内稳态还不得而知。本文将说明小鼠小肠新鲜分离的Lgr5+CBC细胞和潘氏细胞能展现不同的代谢程序。
原名：Interplay between metabolic identities in the intestinal crypt supports stem cell function
译名：肠腺窝中代谢物的相互影响维持干细胞功能
期刊：Nature
IF：40.137
发表时间：2017年
通信作者：Boudewijn M.T.Burgering
通信作者单位：Molecular Cancer Research, Center Molecular Medicine, University Medical Center Utrecht, Heidelberglaan 100, 3584CG Utrecht, The Netherlands.
1. 腺窝不同区域代谢情况
研究人员采用LC-MS/MS代谢组学方法，分析由Lgr5-GFP小鼠小肠分离的Lgr5+CBC、潘氏细胞和CD24-Lgr5-细胞代谢组变化，主成分分析（PCA）结果显示不同的细胞，具有清晰的代谢谱特征聚类差别。
图1 流式分选得到的三种不同细胞系代谢组学数据的PCA分析
丙酮酸/乳酸比值在不同细胞中有所差异，Lgr5+CBC中比值增高，表示在Lgr5+CBC中线粒体相关活动增强。
图2 不同细胞丙酮酸/乳酸比值
线粒体和线粒体膜电位（MMP）实时成像分析的结果也说明Lgr5+CBC相较于毗邻的潘氏细胞，线粒体相关活动更强。值得说明的是，更强的线粒体活跃程度并不是导致Lgr5+CBC中氧化还原应激增强的必要因素。
图3 线粒体/线粒体膜电位实时成像分析，结果也说明CBC位于潘氏细胞之间
2. WENR类器官的特征
在标准培养基中（ENR）培养的类器官能够长成具有特定腺窝区域的微肠（mini-guts），然而添加了Wnt3a的条件培养基（WENR）只形成球形类器官，缺乏已分化细胞，均匀增殖，这些特点都与微肠类器官不同。干细胞标志物Lgr5和Olfm4在球形类器官中表达下调，胚胎干细胞标志物（Trop2和Spp1）表达增加。将球状类器官的培养基从WENR换成ENR，即建立起研究细胞分化先于腺窝形成的模型。
图4 a图 WENR类器官基因表达结果（qpcr法检测）；b图mini-gut（ENR）和球状类器官免疫染色成像图
当与mini-guts进行比较时，球形WENR类器官展现更强的糖酵解代谢能力。相应的，球形类器官的丙酮酸/乳酸比值有所降低。丙酮酸脱氢酶激酶1受到二氯乙酸（DCA）抑制，因此进一步抑制糖酵解，致使增殖减少。通过添加DCA或者2-脱氧-D-葡糖糖致使糖酵解紊乱，增加了每个类器官中腺窝的数量，上调了潘氏细胞标志物Lyz1和Lyz2的表达。
图5 c图 糖酵解压力分析测定糖分解能力；d图 用DCA处理WENR类器官单元；e图 添加DCA进行分化测定，分析糖酵解抑制腺窝形成
3. 线粒体相关OXPHOS和ROS信号促进分化和腺窝形成
一旦糖酵解紊乱，ATP的生成就会依赖线粒体中氧化磷酸化过程（OXPHOS）,因此研究人员进一步研究OXPHOS如何影响分化。半乳糖通过Leloir代谢途径，激活OXPHOS，而用半乳糖替换葡萄糖增强了腺窝的形成，表明线粒体激活促进了分化。类器官腺窝生成始于细胞密度的增加、芽状结构的形成，同时线粒体相关活动随着腺窝的形成而增强。进一步的研究结果表明线粒体电子传递链相关活动是腺窝形成初期所必须的。
增强的线粒体活动，导致了线粒体相关氧化还原发生变化和产生ROS信号。从而可能导致分化和形成腺窝。
图6 a图 分化过渡阶段，JC-1染色的类器官中线粒体和高MMP线粒体的共聚焦图；b图mtGrx1-roGFP类器官中线粒体氧化还原状态分析成像图
4. p38活性促使分化和形成腺窝
p38 MAP激酶负责对细胞氧化还原变化进行应答。在类器官中，线粒体来源的ROS信号激活p38，并且其活性在分化过程中增加。研究人员采用p38KTRClover检测p38在细胞水平的激活状态，确认了线粒体ROS激活了p38。在分化过程中，p38在新生的潘氏细胞和CBC中激活，活性在出芽位置增加。p38活性在腺窝成熟过程中得到维持，不过在成熟的腺窝中，靠近绒毛区域活性降低。免疫组化的结果还说明在潘氏细胞、CBC和腺窝基部，磷酸-p38的量增加。因此，线粒体OXPHOS通过ROS信号介导的p38激活机制，促进细胞分化和腺窝形成。
图7 a,b图p38活性成像图；c图 不同腺窝形成时期p38的活性；d图 小鼠肠截面p38和pp38免疫组化结果
5. Lgr5+CBC干细胞功能的新陈代谢调节作用
研究人员引入了类器官重构分析法，用于确认代谢在维持干细胞功能的作用。潘氏细胞用糖酵解或者葡萄糖的抑制剂预处理后，当与Lgr5+ CBC进行重构时，乳酸转运蛋白在维持腺窝形成上效率低下，而用OXPHOS抑制剂进行处理，潘氏细胞保留了niche-supporting功能。相反的，用OXPHOS抑制剂处理Lgr5+CBC时，类器官单元重构明显减少，而其它的抑制剂作用甚微。因此，潘氏细胞糖分解表型及Lgr5+CBC中增长的OXPHOS是支持壁龛细胞和干细胞功能的重要因素。进一步分析的结果显示，Lgr5+CBC中乳酸转化为丙酮酸，向线粒体OXPHOS提供能量，从而导致了ROS信号产生、p38的激活及细胞分化。
本文作者介绍了线粒体OXPHOS代谢性过渡，对于促进细胞分化是极其重要的。该代谢性过渡激活了p38,最终通过自我更新调节干细胞功能。