科研 | ISME: 时空差异调控根际生态位分化
编译：橙，编辑：小菌菌、江舜尧。
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根际作为微生物碳转化的热点区域，是土壤有机质（SOM）的重要前体及根多糖和聚合碳水化合物的合成起始点。然而，根际碳水化合物降解的微生物生态机制目前尚不清楚。
作者利用常见的一年生草本植物野麦草，进行沿生长时间尺度的宏转录组测序，并比较了根际、碎屑周际（detritusphere）和根际-碎屑层复合环境中的微生物功能差异。转录本使用特定参考数据库（根际SIP宏基因组（SIP-MG），土壤宏基因组（MG），培养分离的基因组（I），单细胞扩增基因组（SAG））进行比对。
尽管土壤生境对群落组成和基因表达都有显著影响，但微生物在时间尺度上发生的功能演替要更快。此外，作者利用上调的降解基因聚类分析，确定了四个不同的微生物共位群（根际，碎屑周际，衰老根（Aging Root）共位群以及“低响应”群体），这些类群的功能演替模式表明，由新鲜生长的根、腐烂的根碎屑或老化的根提供的基质是专一化的。
碳水化合物降解基因在根际上调，并且在根际-根碎屑的结合中，物种分类多样性和功能多样性最高，表明根际微生物共位群（guilds）的共存促进了生态位分化。宏转录组定义的共位群可用于模拟根际演替及其对土壤碳循环的影响。
论文ID
原名：Niche differentiation is spatially and temporally regulated in the rhizosphere
译名：时空差异调控根际生态位分化
期刊：ISME
IF：9.49
发表时间：2020.1
通讯作者：Erin E. Nuccio&Jennifer Pett-Ridge
作者单位：劳伦斯利弗莫尔（LLNL）国家实验室物理与生命科学研究部
实验设计
具体实验细节：将50g土壤与0.4g根碎屑混合，然后将其撒布在100g的侧室(slidecar)土壤上，将未添加根碎屑的土壤撒布在无碎屑的对照处理。在每个时间点，我们对根际土壤和非根际土壤进行破坏性采样，包含两种处理（带或不带根碎屑），三个生物学重复共收集48个样品（24个根际，24个非根际土壤）。并进行提取DNA和RNA，进行宏转录组，iTags（16S，ITS）测序；对于转录组文库，首先去除植物和细菌的核糖体RNA，反转录为cDNA，对cDNA进行测序。使用iTag测序进行16S V4区（引物515F，805R）和ITS2区（引物ITS9，ITS4）群落分析。使用细胞释放缓冲液洗根际土壤附着的根，形成根际细胞悬液，后续使用Illumina NextSeq平台对16S rRNA基因的SAG进行扩增测序。测序结果进行后续生物信息学分析，针对转录组测序结果，作者使用特定的基因组数据库Soil-specificreference database进行比对，该数据库由根际SIP宏基因组（SIP-MG），土壤宏基因组（MG），培养分离的基因组（I），单扩增基因组（SAG）组成。
结果
1. 微观培养箱中土壤特性
根碎屑的添加使土壤碳从2.0％±0.1增加到2.8％±0.1，样品采集时土壤含水量平均为每克干土中0.34±0.067g水，但最终时间点（第24天）除外，由于植物的蒸腾作用，微观培养箱的平均含水量为每克干土中0.11±0.013g水。根碎屑的添加整体土壤pH值在第一个时间点显着增加了0.14，这种差异随时间的推移而减小。
2. 根际和碎屑周际（detritusphere）中微生物群落和功能迅速变化
NMDS排序图中可以看到16S cDNA和mRNA转录本在非根际土壤和根际及有无碎屑两个分组中差异明显（fig 1.a,c），表明根系和碎屑会迅速改变细菌群落的结构和功能构建。PERMANOVA多因素方差分析表明根际和碎屑层显著影响群落组成（fig 1.a）。培养时间的变化解释了整个群落变异性的19％，表明在不同处理内部可能发生了物种演替。相反，真菌群落组成在根际和非根际无明显差异，而在有无碎屑处理的分组中存在显著差异（fig 1.b）。时间是造成细菌基因表达的主要因素，第22天的mRNA转录本与早期时间点明显不同（fig 1.c）。土壤水分和时间可能是造成变化的原因。仅考虑前三个时间点（第3、6、12天）时，根际和碎屑处理是造成群落差异的主要因素。
图1. NMDS排序分析根和根碎屑对野燕麦生长期间（3、6、12、22天）土壤微生物群落及其转录本的影响。扩增子测定微生物群落组成：a细菌16s cDNA，b真菌ITS cDNA，转录本测定的功能组成：c总mRNA。符号代表四个实验处理：根际（实心）、非根际土壤（空心）；添加的根碎屑（红色）或不添加（蓝色）。
3. 根碎屑增加了物种和功能多样性
研究发现添加根碎屑增加了根际和非根际土壤物种和功能香侬多样性，并且根际-根碎屑组合的处理在最终时间点具有最高的总体物种多样性（fig.2a）。物种香侬多样性基于16S rRNA基因序列计算。非根际土壤中添加根碎屑显着增加了KEGG功能多样性，并且对根际土壤具有相似的影响，尽管趋势不显著（fig.2b, p <0.05）。四种处理中，第22天后根际土壤具有最高的功能多样性。
4. 根刺激降解碳水化合物基因表达
作者研究了一组与碳水化合物降解相关的CAZyme基因，并评估了相对于非根际土壤处理的碳水化合物将解转录本的表达。总体而言，根际群落的d-CAZy基因上调最为明显（fig.2c）。除第22天，未经处理的根际土壤具有最高的上调基因数量，根际－碎屑处理具有最大数量的上调d-CAZy基因。该结果在四个主要CAZyme（辅酶，碳水化合物酯酶，糖苷水解酶，多糖裂解酶）中总体上是一致的。在非根际土壤中，添加碎屑最初刺激了d-CAZy活性的急剧上升，但随着时间的推移，这种活性急剧下降，到最后一个时间点，只有10–20％的基因与土壤整体表达水平有区别。
图2. 在22天生长期，从野燕麦培养箱中采集根际和非根际土壤中的物种分类和功能多样性。a. 16S rRNA基因 b. 微生物群落mRNA转录本KEGG功能基因的α多样性（香侬多样性）。c. 相对于非根际土壤，显著上调的分解CAZy基因的累积数量。不同处理：根际+碎屑（实心红色圆圈，实线），根际（空心红色圆圈，虚线），非根际土壤+碎屑（实心蓝色方块，实线）和未经处理的非根际土壤（空心蓝色方块，虚线）。
5. 根际和碎屑周际（detritusphere）中已实现的生态位
使用特定参考数据库，作者发现了具有统计学意义的基因表达的聚集种群，并确定细菌群落中“已实现的”代谢生态位（fig.3）。尽管许多微生物分类群具有碳水化合物解聚的能力，但只有一小部分显着上调了这些基因。相对于非根际土壤而言，纤维素酶和木聚糖酶的表达上调的种群占所有基因组总基因组潜力的12-16％和11-21％（fig.3）。促旋酶A和B基因的表达模式表明，总体群落动态与功能基因观察到的模式相类似。
图3. 关键碳水化合物降解基因的基本特征（基因组潜力）与已实现的代谢生态位（基因表达上调）。维恩图面积表示功能活跃类群的数量大小，外圈（棕色）表示参考数据库中具有特定基因的基因组数量；内圈反映了不同处理相对于非根际土壤显著上调基因的分类单元的数量：根际（绿色），根际+碎屑（粉红色）和非根际土壤+碎屑（蓝色）。分析的基因组类别包括：促旋酶A，B，寡糖水解酶，纤维素酶和木聚糖酶。
6. 时间和生境定义的微生物共位群 (guilds)
作者评估了随时间推移以及跨生境的基因转录模式，以定义微生物共位群。24个表达的CAZy基因中，至少有四个相对于非根际土壤显着上调，这些种群中的大多数（15个）都来自SIP宏基因组数据库，并具有转录偏好（fig.4）。根据基因上调结果，作者定义了根际，碎屑周际，衰老根（Aging Root）共位群以及一个“低响应”群体，表示无明显的生境偏好。
图4. 时间序列热图表示在22天的野麦草培养实验中，各基因组CAZy基因表达；参考基因组分类法列出了基因组来源：根际SIP宏基因组（SIP-MG），土壤宏基因组（MG），培养分离的基因组（I），单个扩增基因组（SAG）。时间（天）由列表示。聚类结果表明不同的微生物共位群，并用左侧的灰色条和数字表示。星号表示d-CAZy转录策略，星号颜色表示不同的丰度上调情况。
7. 碳水化合物降解共位群存在功能继承
根际和碎屑周际共位群在最初的6天内具有较高的d-CAZy表达，在12到22天内又出现了一个衰老根共位群（fig.4）。根际共位群包含变形菌门伯克氏菌目和一个来自于疣微菌门丰佑菌科的共位群（fig.4，第1组）。总体而言，木葡聚糖水解酶是根际共位群的特征，并且在碎屑周际中仅观察到一次（fig.5）。
碎屑周际共位群在系统发育上是多样的，包括来自变形杆菌，纤维杆菌，拟杆菌和放线菌的类群（fig.4，第2组）。除根瘤菌类群外，碎屑周际共位群的成员通常在添加碎屑后不久（3、6天）上调纤维素酶和木聚糖酶，并使用纤维素酶或木聚糖寡糖水解酶作为潜在的分解产物（fig.5）。在衰老根共位群中，来自链霉菌科和链孢菌科的放线菌菌群在最后的时间点（22天）在根际中具有较高的d-CAZy基因表达，而在碎屑改良处理中具有早期基因表达（fig.4，第3组）。衰老根共位群几乎没有淀粉、糖原、细胞壁和二糖分解的基因上调（fig.5）。
图5. 分类为本研究的24个细菌的降解CAZy基因的上调基因（根际，碎屑周际，衰老根，低响应群）
8. 基于共位群的d-CAZy转录策略
作者使用宏转录组表达模式确定了微生物共位群中三种d-CAZy转录策略的普适性（fig.4）：a.丰度增加b.基因表达上调c.上调基因表达。降解策略因人而异（因共位群成员本身功能而异），并非互斥。根际和碎屑周际共位群所有成员都是“生产者”（Growers），并且数量增加（fig.4）。根际共位群的分类群是“上调者”（平均基因表达高三倍），相反，碎屑周际共位群的酶表达与丰度相似，没有“上调”，超过一半的“衰老根共位群”的丰度没有变化，该共位群完全由放线菌组成。
讨论
根部周围的土壤微生物群落经历了与植物生长阶段相对应的物种组成演替。然而，关于根际演替过程中微生物基因表达以及功能演替与群落变化之间的时间关系知之甚少。作者使用了以基因组为中心的转录组学进行比较，表明微生物分类群具有特定的功能和基于根生境时空差异的生命策略。由于许多土壤微生物无法通过常规方法进行培养，因此该方法可提供仅通过测序已知的种群生理学认知。此外利用时间分辨率的宏转录组学评估特定微生物分类群的活性以及导致群落构建显得十分重要。
结论
生态位分化是共存理论的核心。利用以基因组为中心的转录组学来确定土壤类群的已实现代谢生态位，作者发现碳水化合物解聚团在根际群落组装过程中迅速出现，并确定了三种d-CAZy转录策略（Grower，Upregulator，Synergist）在根际的普遍性。此外，这些分类群同时使用初级和分解产物，这些结果支持最近的研究，即代谢转移将微生物群落的相互作用成员联系在一起。
结论
本研究通过精细的微型培养实验，并使用宏转录组技术评估了在时间梯度及不同生境下的微生物分类组成及功能表达特征。此外，在文章应用基于不同生长时期和生长环境的微生物生态学共位群（guilds）概念，用以表征不同生长期及不同生长环境下，微生物群体的功能特征，值得借鉴。此外，稳定性同位素标记技术（SIP）结合宏基因组学用于鉴定功能活性微生物，提供了重要的研究技术手段。
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