科研 | Water Research：野火后地表水和地下土壤的微生物质量
编译：小白同学，编辑：小菌菌、江舜尧。
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来自野火所掠地区的径流通常携带高浓度燃烧过的灰烬或被侵蚀的沉积物，这些沉积物将会留存在地表水体或地下土壤中（图1）。尽管火烧残余物在这两种环境中加剧化学污染物浓度已为人所知，但对于它是否以及在多大程度上可能造成微生物污染，还知之甚少。为研究火烧残渣对病原指示物大肠杆菌生长凋亡的影响，本研究将雨水与大肠杆菌混合，在发生野火地区取样将经火烧前后的土壤颗粒物散入其中，监测大肠杆菌浓度。最初大肠杆菌在两种情况下都在生长，但在火烧残渣组，大肠杆菌的相对浓度比未受野火影响地区的自然土壤处理组低10倍，经过15天的培养，野火残渣也使大肠杆菌减少。这些结果表明，在野火残留物存在时，大肠杆菌在地表水中的生长存活少于在未经燃烧的土壤颗粒环境中，这可能是由于燃烧后营养物质耗尽或野火残留物使细菌丧失生存能力。为了考察地下野火残留物的移动性及其对大肠杆菌迁移的促进，本研究通过向不饱和沙柱土壤模型体系中注入含有野火残渣和/或大肠杆菌的悬浮液。随着深度的减小和颗粒浓度的增加，沙柱中野火残渣的迁移量增加，但这并没有导致大肠杆菌迁移量的增加，说明野火残渣对大肠杆菌的迁移无促进作用。总之，该研究认为野火残余物不会经地下渗透增加地表水或地下水被微生物污染的风险。
论文ID
原名：Microbial quality of surface water and subsurface soilafter wildfire
译名：野火后地表水和地下土壤的微生物质量
期刊：Water Research
IF：7.913
发表时间：2020.03
通讯作者：Sanjay K. Mohanty
通讯作者单位：加州大学洛杉矶分校市政与环境工程学院
实验设计
收集来自洛杉矶巴罗纳溪的雨水作天然水本底，用于检验当雨水与野火受灾地区的径流混合后大肠杆菌的动态变化。收集到的雨水至少静置24小时以沉淀大颗粒，上清液转移到玻璃容器中，121℃高压蒸汽灭菌45分钟以免与外加大肠杆菌争夺营养物质，无菌雨水于4℃保存。对照组为未发生火灾的湿地天然土壤，实验组为从近期发生火灾的公园和湖边采集带有野火残余物的烧焦土壤，采样点根据雨水径流路线选择。用无菌铲刀采集土壤表层10cm处样品于4℃保存；生物炭颗粒用于代替炭黑。野火残渣样品经充分混合后取两份用核磁共振波谱仪对火灾残余物质13C同位素进行表征。为分析土壤淋溶液中养分浓度，取各类样品4g于40 mL Milli-Q水中震荡24 h，离心后上清液测定硝酸盐、亚硝酸盐和磷酸盐、溶解性有机碳和总氮含量。
为制备火烧前后土壤的悬浮液，过45 mm筛的2g样品加入到1 L去离子水中并转移至500毫升的量筒。由于大颗粒在过滤和重力沉降作用下迁移能力有限，本研究分离出小于10mm的颗粒（于上清液中未沉降）用于淋溶研究。取悬浮液移入离心管，4000 g离心15 min，弃上清留下浓缩的颗粒物悬浮液5ml，在使用前先摇匀并超声处理1分钟，其粒径分布由粒度分析仪测定。本实验中根据前人方法制备具有卡那霉素抗性的大肠杆菌悬浮液，排除环境中大肠杆菌的污染。在LB培养基中获得大肠杆菌单菌落，离心后去上清，并用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗。所得菌液加入到含有颗粒的雨水中，震荡混合120 min以确保细菌附着在颗粒上。为研究火烧残渣是否影响雨水中大肠杆菌的生长情况, 在50 mL无菌雨水中加入大肠杆菌（103 CFU /mL）和各组土壤样品（100 mg/L），混匀并在37℃下培养15天，设置不添加土壤颗粒的对照处理。分别在0.3、0.8、1、2、3、4、7、9、11和15天，吸取样品对大肠杆菌进行计数以监测其浓度变化。样品接种于含卡那霉素的LB平板并进行涂布，每个样品涂两个平板。若浓度过高则用PBS缓冲液进行稀释后再涂布使平板中菌落数在30~300之间。样品中细菌浓度为两平板菌落数的平均值，单位为CFU/mL，批实验中细菌的相对浓度由大肠杆菌在样品中浓度和其初始浓度(C0)的比值表示。
结果
1 颗粒类型影响大肠杆菌生长凋亡
养分浸出结果表明，从未燃烧的土壤中浸出的养分比火烧后土样多，即火灾消耗了土壤养分。燃烧残留物的核磁共振分析发现有其中有脂肪族、芳香族、羧基和羰基官能团的存在，进一步证实了这种变化。雨水中的大肠杆菌在颗粒物存在情况下数量有所增长，不同来源颗粒样品增长程度并不相同(图2)。大肠杆菌的生长周期经历了增长阶段、稳定期和衰退期，不同颗粒物类型维持稳定期时间不同，也决定了稳定期后的增减变化。无颗粒物雨水中，大肠杆菌浓度7天后增长到初始浓度的79倍，而在有自然土壤颗粒存在时增长更快，但野火残留物或生物炭颗粒存在时仅增加约20-30倍，比自然土壤颗粒组少近10倍。此外与未烧过的土壤（11天）相比，野火残渣组（4-7天）大肠杆菌的增长阶段更短。4-11天期间，野火残渣组和生物炭组大肠杆菌浓度相近，与自然土壤组显著不同；培养11天后大肠杆菌浓度在野火残渣组急剧下降，但在自然土壤颗粒组仍然很高。培养15天后野火残组大肠杆菌的存活率低于自然土壤组，此时野火残渣组和生物炭组大肠杆菌浓度已低于检测限。
图2 在无添加物或有野火残渣、自然土壤和生物炭的情况下，雨水中大肠杆菌的生长情况。
2 深度影响悬浮颗粒的去除
自然土壤中悬浮颗粒在淋溶过程中被截留，截留量随柱长变小而减少(图3a)；柱长与出水浓度负相关(皮尔森相关系数0.940)，与悬浮颗粒去除率正相关。无颗粒对照中的大肠杆菌也有类似趋势(图3b)，这里大肠杆菌可看作颗粒，截留率始终高于土壤颗粒，说明其吸附作用强于土壤颗粒。增加1cm砂层可使悬浮固体去除率提高1.9%，增加进水中颗粒物浓度不会改变出水浓度，但改变了各个粒径组分的浓度分布：进水浓度高时出水中小颗粒较少，更多的大颗粒通过砂滤。
图3 无菌雨水以9.0 mL/min淋溶时注入1.0 mL颗粒物悬浮液(4.0 g/L)，沙柱深度对悬浮颗粒去除的影响。(a)随着沙柱深度的增加，悬浮物浓度峰值降低且峰值形心出现得更早。(b)随着沙柱深度的增加细菌运移减少。(c)悬浮颗粒物和细菌的去除率随沙柱深度增加而增加。
3 颗粒类型影响悬浮颗粒的去除
悬浮颗粒的去除率取决于颗粒类型和浓度，尽管颗粒物可以穿过沙柱，大肠杆菌的运移未受到强化（图4）。当进水颗粒物浓度小于0.7 g/ L时去除率均为100%，而大于0.7 g/ L时去除率随浓度升高而下降且与颗粒来源有关。例如自然土壤中颗粒物浓度为3 g/ L时去除率下降到62%，活性炭中颗粒浓度为2.9 g/ L时去除率降至96%。当悬浮颗粒浓度大于2.0 g /L，生物炭组的去除效率是自然土壤组的10倍，野火残渣组的去除情况更接近于自然土壤组而非生物炭组。虽然去除率随进水浓度的增加而降低，但在野火残渣组大肠杆菌已被完全去除，说明它们对于促进土壤中大肠杆菌迁移的作用不大。沙柱截留了大部分悬浮颗粒，仅使细颗粒(直径< 3毫米)通过(图5)。对各类基质，进水粒径都大于出水，表明沙柱对颗粒具有截留作用。进水溶液颗粒物粒径分布于野火残渣的6.53 mm到生物炭的15.08 mm，出水则为生物炭组的0.55 mm到自然土壤和野火残渣的1.35 mm，进水颗粒物浓度的增加对出水粒度分布产生的影响未达到统计学显著水平。
图4 20cm沙柱中不同来源颗粒和大肠杆菌的去除情况。
图5 进水(上)和出水(下)样品中悬浮颗粒粒径分布因其来源不同而有差异。
讨论
1 地表水中野火残渣抑制细菌生长
研究发现，地表水中病原指示菌的生长情况受悬浮颗粒的影响，与颗粒来源有关，即是否含有野火残渣。与自然土壤相比，野火残渣抑制细菌生长、加速其凋亡。天然土壤颗粒含有有机质和土壤矿物质，可作为细菌有效养分；而野火残渣主要由有机物燃烧所剩灰烬和焦炭组成，使水体养分浓度减少，造成大肠杆菌生长受到抑制，微生物存活情况发生明显变化，与其他基于天然土壤颗粒的研究结果相似。野火残渣还可能溶出重金属，对细菌产生毒性。将硝酸盐和磷酸盐混入含相似浓度的野火残渣悬浮液中，混合后的养分浓度几乎没有变化，表明野火残渣对雨水中养分的吸附不影响实验结果。另一种可能性是，野火残渣或土壤颗粒可能吸附了多个大肠杆菌，而在琼脂平板上形成一个菌落，从而低估了大肠杆菌的实际浓度，尤其是对于吸附能力较强的生物炭。与生物炭相比，野火残渣中含有土壤、灰分和少量炭黑，形成的混合物对大肠杆菌的亲和力较低。该结果可能因燃烧物性质的不同而变化，也可能因在运至地表水过程中混入其他颗粒而造成差异。总之，野火残渣流入地表水不会导致病原菌浓度增加。
2 颗粒物去除率随沙柱深度增加而提高
实际环境中地层深度差异大，因此有必要了解地层深度是否会影响野火残渣对地下水的潜在污染。通过注入生物炭或自然土壤(两种极端情况)，研究发现沙柱深度的增加提高了野火残渣的去除效果，或可归功于较长的水力停留时间和较多的吸附位点；但随着颗粒浓度的增加，去除量减少，或可归咎于吸附位点用尽。
当进水颗粒浓度为2.0 g/L时，自然土壤颗粒去除率仅为62%，明显低于相同条件下生物炭颗粒去除率(96%)。结果表明，火烧残渣与砂粒相互作用较强，在土壤中较易于被截留。
3 野火残渣在土地中的淋溶情况更接近自然土壤而非生物炭
当颗粒浓度大于0.7 g/L时，生物炭颗粒的去除率约为96%，明显高于自然土壤和野火残渣去除率(44%~68%)。生物炭颗粒可以作为絮凝作用的凝结核，形成更大的胶体，比细小的野火残渣或土壤颗粒更容易被截留。此外，核磁共振分析证实了野火烧蚀过程中土壤表面性质发生了变化，火灾残留物中除土壤外还含有不少炭黑和灰烬，这会影响其截留作用。野火残留物已被证明含有较多芳香碳，这降低了其极性并增加了其疏水性。生物炭颗粒的去除率高于野火残渣，或许不能代替野火残渣来研究其在土层中的运移情况。尽管二者是在相似温度条件下形成的，但生物炭是在无氧情况下产生的，而野火残渣是在有氧环境中形成的，灰分含量更高，生成条件这一关键差异或可影响其在地下渗滤过程中的截留作用。
4 胶体颗粒(< 3mm)难以在地下渗滤过程中被截留
地下渗滤过程中，绝大多数粒径大于3mm的颗粒都能够被截留，无论其来源或类型。出水中粒度分布表明，与自然土壤和野火残渣相比，注入生物炭样品时，出水中细颗粒数量更多。出水中颗粒粒径与细菌接近，相同条件下细菌可以通过沙滤装置，除非菌沙间相互作用强于野火残渣与沙的相互作用。但出水中大肠杆菌浓度低于检出限，说明细菌与砂土表面的相互作用较大。出水中细小胶体并未促进细菌的运移，即野火残渣不会通过胶体推动大肠杆菌迁移。实际上，本研究中胶体反而阻碍了细菌运移。在没有土壤胶体的情况下，10cm沙柱的细菌截留率约为75%，深度增加10cm后细菌截留率增加到接近100%。悬浮颗粒和细菌同时存在的情况下，无论颗粒物性质怎样，20厘米沙柱中细菌的截留率都保持在100%。本研究中，粒径大于3mm的颗粒被滤层截留，沉积的颗粒会堵塞砂层中的孔隙或流动路径，从而强化对细菌的截留。通过分析粒度分布发现，生物炭颗粒比野火残渣和自然土壤更具流动性，出水中的粒径相对更小。所取土样粒度分布相近，流出物可能以土壤矿物为主，而非烧过的碳黑。但这些颗粒并没有影响出水中大肠杆菌的浓度，表明它们在地下土壤中的沉积不会增加病原微生物扩散的风险。本研究所得结果可能会因菌种不同而有所变化，需要注意的是病毒体积极小，难以被截留，发生野火后病毒传播速度可能远远快于细菌。因此未来应进行病毒和病原菌方面的研究而非本研究中所用指示菌。
结论
本研究就野火后降雨是否会增加地表水、土壤和地下水的微生物污染风险予以解答：
1与自然土壤相比，地表水中的野火残渣抑制大肠杆菌生长，促进其凋亡，野火过后遭微生物污染的风险微不足道。
2病原菌难以通过野火残渣在土壤中传播扩散，尽管颗粒浓度超过0.7 g /L时其淋溶作用有所增强。
3生物炭颗粒在土壤中的淋溶量小于野火残渣，即生物炭并非研究野火残渣在土壤中扩散规律的良好指示物。
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