编译：Rivc，编辑：小菌菌、江舜尧。
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导读
植物生长在一个复杂的物种网络中，这些物种相互作用，并与植物相互作用。这些相互作用由一系列广泛的化学信号控制，根际的化学景观会强烈影响根的健康和发育。在这里，为了理解微生物之间的相互作用如何影响拟南芥的根生长，本研究建立了植物、微生物和环境之间相互作用的模型系统。
本研究用185个成员的细菌合成群落接种幼苗，操纵非生物环境并测量植物的细菌定殖。这使本研究能够将合成群落分为四个共生菌株模块。本研究在这些模块的基础上解构了合成群落，并确定了决定根表型的微生物之间的相互作用。这些相互作用主要涉及一个细菌属(Variovorax)，它完全逆转了由多种细菌菌株和整个185个成员的群落诱导的根生长的严重抑制。本研究证明Variovorax操纵植物激素水平来平衡本研究的生态现实的合成根群落对根生长的影响。本研究鉴定了一个生长素降解操纵子，它在Variovorax的所有可用基因组中是保守的，并且对于逆转根生长抑制是必要和充分的。因此，代谢信号干扰塑造了细菌-植物通讯网络，对维持根的定型发育程序至关重要。为优化根际形成化学相互作用网络的提供反馈，并为开发更具弹性和生产力的作物提供了一个有希望的生态策略。
原名：A single bacterial genus maintains root growth in a complex microbiome译名：一种单独的细菌属在一个复杂的微生物群落中帮助保持根的生长
细菌培养和植物接种：本研究使用的185个细菌合成群落包含从表面灭菌的十字花科植物根中获得的基因组测序分离物，所有的拟南芥都种植在美国北卡罗来纳州的两种土壤中。细菌培养物在28℃生长，以250转/分的速度摇动。生长5天后，将培养物接种到新鲜培养基中，并返回培养箱再培养48小时。采用这一程序来解释合成群落不同成员的可变生长率，并确保来自每个菌株的非稳定细胞包含在接种物中。
离体植物生长条件：所有种子用70%漂白剂，灭菌8分钟，并用无菌蒸馏水漂洗3次，以消除种子表面的任何种子携带的微生物。种子在黑暗中于4℃分层2天。在先前报道的磷酸盐浓度梯度(0、10、30、50、100和1，000微米圆周率)上增加了三个额外的环境梯度:盐度(50、100、150和200毫摩尔氯化钠)、酸碱度(5.5、7.0和8.2)和培养温度(10、21和31℃)。将平板以随机顺序放置在生长室中，并在16小时黑暗/8小时光照条件下，在21℃白天/18℃夜晚生长12天。收集后，从根、芽和琼脂基质中提取DNA及测序。
为了在完全受控的环境中模拟植物-微生物群的相互作用，本研究建立了一个植物-微生物群的微观世界，它代表了琼脂平板上天然的细菌根来源的微生物群。本研究用由主要的与根相关的门组成确定185个细菌合成群落，接种7天龄的幼苗(图1a)。本研究通过操纵四个变量(盐度、温度、先前报道的磷酸盐浓度梯度和酸碱度)中的一个，将这个微观世界暴露于16种非生物环境中的每一种。本研究用16S rRNA扩增子测序法测量了接种后12天根、茎和琼脂部分合成群落的组成。表1为不同研究地点与树木健康状况相关的土壤化学性质。
在土壤种植的拟南芥中，所产生的根和芽微生物群的组成概括了系统水平的植物富集模式(图1b)。使用接种了相同合成群落的无菌盆栽土壤中生长的幼苗，验证了在基于琼脂的系统中观察到的模式。在独特的序列水平上，相对丰度和植物富集模式在基于琼脂和基于土壤的系统之间显著相关，这证实了本研究的相对高通量的基于琼脂的系统作为组装的模型的适用性。在琼脂中，组分(基质、根或茎)和非生物条件都显著影响α和β多样性(扩展数据图1d–f)。为了将合成群落分解成模块，本研究计算了所有样本中相对丰度的成对相关性，并确定了共发生菌株的四个明确的模块，本研究称之为模块A、B、C和D(图1a，补充表2)。这些模块形成了与植物相关的独特的系统发育结构。模块A主要含有γ-谷氨酰胺原生菌，主要在基质中比在幼苗中更丰富；模块B主要含有低丰度的厚壁菌门，没有明显的富集趋势；模块C和模块D分别主要由α-变形菌和放线菌组成，并在所有非生物条件下显示植物富集。α变形菌(模块C)和放线菌(模块D)在植物物种中始终富集，这表明这些分支包含深深植根于其进化史的植物关联特征。本研究接下来研究了共存菌株的不同模块在决定植物表型中是否有不同的作用。本研究用由模块A、B、C和D单独或以所有六种可能的成对组合组成的合成群落接种幼苗，并在接种后12天对幼苗进行成像。本研究在接种了植物富集模块C或D的幼苗中观察到强烈的初生根生长抑制(RGI)(图1b，C)。接种了不含植物富集菌株的模块A或模块B的幼苗没有发生RGI病(图1b)。为了测试来自每个模块的根表型是否是其单个成分的相加结果，本研究接种了与合成群落的185个成员中的每一个单结合的幼苗。本研究观察到，分布在所有4个模块中的34个分类上不同的菌株诱发了RGI病(扩展数据图2a–c)。然而，无论是完整的合成群落还是由模块A或模块B组成的衍生合成群落都没有表现出RGI现象(图1b)。因此，在这种复杂的群落环境中，二元植物-微生物相互作用不能预测相互作用。在接种了模块对的幼苗中，本研究观察到上位性相互作用:在模块A的存在下，由模块C和D引起的RGI被逆转(图1b，C)。因此，通过将合成群落分解成四个模块，本研究发现细菌对根生长的影响受多种水平的微生物-微生物相互作用的控制。至少有四个例子可以说明这一点:在模块A或B内部，以及在模块A和模块C或d之间。
图1 拟南芥根的长度是由群落内的细菌-细菌相互作用决定的为了识别模块A中负责RGI模块内和模块间衰减的菌株，本研究将本研究的系统简化为植物-微生物-微生物三方系统。本研究从模块A中单独筛选了18个非RGI菌株，以确定它们对由所有4个模块中的代表性菌株引起的RGI病的减毒能力。本研究发现所有来自瓦氏菌属(丛毛单胞菌科)的测试菌株都抑制了由来自模块C(农杆菌MF224)和模块D(节杆菌CL28)的代表性RGI诱导菌株引起的RGI病(图1d)。来自模块A(假单胞菌MF48)和模块B(芽孢杆菌MF107)的菌株没有被Variovorax抑制，而是被两个密切相关的伯克霍尔德氏菌菌株(CL11和MF384)抑制(图1d)。当本研究筛选出两种RGI抑制变异株(CL14和MF160)和伯克霍尔德氏菌CL11对抗一组不同的RGI诱导株时，观察到了类似的模式。Variovorax减弱了本研究测试的18个RGI诱导菌株中的13个(扩展数据图3a)。为了测试本研究在琼脂上观察到的RGI诱导和抑制是否也发生在土壤中，本研究在无菌土壤中接种了一对RGI抑制和诱导菌株:RGI诱导节杆菌CL28和RGI抑制变异节杆菌CL14，使拟南芥发芽。不出所料，节杆菌CL28诱导了RGI病，该病被土壤中的变异杆菌CL14逆转(图1e)。本研究通过显示Variovorax介导的RGI衰减扩展到番茄幼苗来概括这一观察，其中Variovorax CL14逆转节杆菌CL28介导的RGI(扩展数据图3b)。最后，本研究测试了在185个成员的群体中，抑制RGI病毒的菌株是否保持了减弱RGI病毒的能力。本研究比较了暴露于完全合成群落或相同群落的幼苗的根表型，这些幼苗是在放弃了合成群落中存在的所有10个瓦氏菌菌株和/或所有6个伯克霍尔德氏菌菌株之后(图2a)。本研究发现Variovorax是必要的，足以在整个社区内恢复RGI(图2b，c，扩展数据图4a)。这一结果在一系列底物(包括土壤)上以及在各种生物和非生物环境下都是可靠的(图2d-f，扩展数据图4b)。此外，在合成群落中Variovorax的存在增加了植物根网络的总长度和它的枝条大小(扩展数据图4c，d)。重要的是，后者被认为是相对植物适应性的可靠替代物22，23，这表明Variovorax介导的RGI抑制是适应性的。为了确定瓦氏菌减弱RGI的能力的广度，本研究从该属的整个系统发育中测试了额外的瓦氏菌菌株(扩展数据图5a，补充表1)。本研究测试的所有19个变异菌株都逆转了节杆菌CL28诱导的RGI。来自最近的植物相关外群的菌株(嗜酸菌属根21924)没有恢复RGI(扩展数据图5a，b)。因此，所有测试菌株——代表瓦氏菌的广泛系统发育——与多种细菌相互作用，在复杂的群落中实施定型的根发育，独立于生物或非生物环境。重要的是，本研究没有发现证据表明这种表型是通过竞争或拮抗RGI诱导菌株实现的(图2g，h，扩展数据图6)。
为了研究细菌影响根生长的机制，本研究分析了用RGI诱导节杆菌CL28和RGI抑制菌株Variovorax CL14定殖12天的幼苗的转录组，无论是与幼苗单结合还是三结合(图1e)。本研究还对在全合成群落(无RGI)或Variovorax辍学合成群落(RGI)中定居的幼苗进行了RNA测序(RNA-seq)(扩展数据图7a)。在两个实验中，仅在RGI条件下(RGI诱导)显著诱导了18个基因(扩展数据图7a，b)。这些基因中的17个与已经提出的与根apex25相关的功能的基因共表达(扩展数据图7b，c)。剩下的基因GH3.2编码吲哚-3-乙酸-酰氨基合成酶，它与过量的植物激素生长素结合，是后期生长素反应的一个强有力的标记(扩展数据图7b)。生长素的产生是细菌调节植物根系发育的一种有据可查的机制。事实上，来自先前的RNA-seq研究的前12个生长素响应基因显示，在暴露于本研究的RGI诱导条件下的幼苗中，拟南芥中的急性生长素响应显示出平均转录增加(扩展数据图7d)。本研究假设Variovorax对RGI的抑制可能是通过干扰细菌产生的生长素信号来介导的。本研究研究Variovorax对RGI的抑制是否与生长素信号传导直接相关。这些包括植物激素乙烯和细胞分裂素，以及微生物相关的分子模式，如鞭毛蛋白衍生肽flg2230。本研究测试了各种瓦氏菌菌株和伯克霍尔德氏菌菌株CL11还原由生长素(吲哚-3-乙酸(IAA)和生长素类似物2，4-二氯苯氧乙酸)、乙烯(乙烯前体1-氨基环丙烷-1-羧酸(ACC))、细胞分裂素(玉米素和6-苄氨基嘌呤)和flg22肽诱导的RGI的能力。本研究测试的所有瓦氏菌菌株都抑制了由吲哚乙酸或ACC诱导的RGI(图3a)——除了瓦氏菌YR216，其不抑制ACC诱导的RGI，并且不包含ACC脱氨酶基因，这是与该属相关的植物生长促进特征 (扩展数据图5a)。伯克霍尔德氏菌CL11仅部分逆转了ACC诱导的RGI病(图3a)。Variovorax菌株都没有减弱由2，4-二氯苯氧乙酸、flg22或细胞分裂素诱导的RGI病(图3a，扩展数据图8a)。重要的是，这种功能是由Variovorax对生长素的识别介导的，而不是由植物生长素反应本身介导的，因为由2，4-二氯苯氧乙酸诱导的生长素反应(RGI)不会逆转。事实上，本研究发现Variovorax CL14在培养物中降解IAA(扩展数据图8b)，并淬灭由RGI诱导节杆菌CL28引起的拟南芥生长素报告系DR5::GFP的荧光(扩展数据图8c，d)。已知生长素和乙烯协同抑制根的生长。为了确定植物对生长素和乙烯的感知在响应RGI诱导菌株中的作用，本研究使用了生长素不敏感的axr2-1变异体和乙烯受体的竞争性抑制剂1-甲基环丙烯(1-MCP)。本研究用RGI诱导节杆菌CL28菌株或Variovorax辍学合成群落接种野生型幼苗和axr2-1突变体，无论是否用1-MCP处理。在这两种情况下，本研究观察到细菌RGI在axr2-1和1-MCP处理的野生型幼苗中减少，并且在双不敏感的1-MCP处理的axr2-1幼苗中进一步减少；这表明植物中的生长素和乙烯感知对细菌诱导的RGI有额外的贡献(图3b)。因此，在没有Variovorax的情况下，复杂的合成群落可以通过生长素和乙烯依赖途径诱导根表型的严重形态学变化，但是当Variovorax存在时，这两种变化都被逆转。为了确定与RGI衰减有关的细菌机制，本研究将合成群落中10个Variovorax菌株的基因组与合成群落中其他175个成员的基因组进行了比较。通过对所有185个基因组进行从头直系同源聚类，本研究确定了947个Variovorax特有的基因，在合成群体的175个非Variovorax成员中患病率< 5%，在所有10个Variovorax菌株中患病率为100%。本研究将这些基因分成物理上相邻的基因区域(基因组热点)，并集中在包含至少10个Variovorax独有基因的12个热点上(扩展数据图9a，补充表3)。其中一个热点(指定为热点33)包含对副伯克霍尔德氏菌植物厚壁菌菌株PsJN18的IAA降解iac操纵子的基因iacC、iacD、iacE、iacF和iacR的弱同源物(平均约30%同一性)，但缺少iacA、iacB和IAci——已知它们是副伯克霍尔德氏菌在IAA17上生长所必需的(图4a，扩展数据图9b)。为了测试本研究确定的热点是否对RGI诱导的细菌有反应，本研究分析了单培养和与RGI诱导的节杆菌CL28共培养的Variovorax CL14的转录组。当与节杆菌CL28共培养时，本研究观察到Variovorax CL14广泛的转录重编程(补充表4)。在本研究确定的12个热点中，热点中的基因是最高度上调的(图4a，扩展数据图9b，c)。因此，本研究假设热点含有一个非特征性的生长素降解操纵子。与此同时，本研究在大肠杆菌中构建了一个Variovorax CL14基因组文库，在一个广泛的宿主范围载体中具有> 12.5 kb的插入片段，并筛选了由此产生的大肠杆菌克隆的生长素降解。从本研究筛选的约3500个降解吲哚乙酸的克隆中筛选出两个克隆(标记为V1和V2)(补充表5)。这两个克隆中的Variovorax CL14基因组插入片段包含热点的部分(图4a，扩展数据图9b)。这两个克隆体共有的重叠包含9个基因，其中包括副粘帚霉iacC、iacD和iacE的弱同源物。为了测试该基因组区域是否足以在植物中恢复RGI，本研究用较短的功能插入物(V2)(图4a，扩展数据图9b)或空载体(EV)转化了嗜酸菌属的根，其不引起或恢复RGI(扩展数据图5a，b)。所得的功能增益菌株嗜酸乳杆菌根219::V2获得了在培养物中降解吲哚乙酸的能力(图4b)。本研究将嗜酸乳杆菌根219::V2或对照嗜酸乳杆菌根219::EV接种到用吲哚乙酸处理的植物上或接种到RGI诱导节杆菌CL28上。嗜酸乳杆菌根219::V2完全逆转IAA诱导的RGI(图4c)和部分逆转节杆菌CL28诱导的RGI，尽管定居根的水平明显低于嗜酸乳杆菌CL14(图4d，扩展数据图9d)。此外，本研究从Variovorax CL14中删除了热点(图4a)，以测试这个假定的操纵子是否是RGI逆转所必需的。所得菌株Variovorax CL14δHS33——其在植物定殖中未受损(扩展数据图9e)——在培养物中未降解IAA(图4b)，且未恢复IAA诱导的(图4c)或节杆菌CL28诱导的RGI(图4d)。因此，这种变异体特异性基因簇对于抑制RGI和生长素降解是必需的。因此，它是Variovorax在系统发育多样的微生物群背景下维持常规根发育所需的关键遗传位点。
图3 Variovorax RGI的抑制与生长素和乙烯信号传导有关。
图4 在变种植物中，生长素降解操纵子是根发育所必需的。信号分子和其他次级代谢物是适应的产物，使微生物在初级代谢物的竞争中存活下来。结果阐明了微生物营养层的重要性，这些微生物利用这些次级代谢物为自己谋利，同时潜在地提供了干扰细菌微生物群和植物宿主之间信号的未选择的解释。这种代谢信号干扰以前已经在群体淬灭、微生物相关分子模式的降解和细菌产生的生长素的降解中得到证实。植物的发育依赖于严格调节的生长素浓度梯度，这种浓度梯度会被微生物群释放的生长素流量所扭曲。一些Variovorax菌株具有生产和降解生长素的能力，这表明有能力微调根际生长素的浓度。我们在这里表明，在一个系统发育多样、现实的合成群落中，Variovorax的存在所增强的化学体内平衡使植物能够在化学复杂的基质中维持其发育程序。最近发现Variovorax在到达一个已建立的群落后具有改善植物定殖的罕见特性，这表明它们使用细菌产生或诱导的底物，而不是植物来源的底物。此外，在重新分析了最近对拟南芥根微生物的大规模时间和空间分辨率调查包括30种植物的普通园林实验之后，注意到Variovorax是在100%的采样地点和植物物种中发现的有限的核心细菌属组之一(扩展数据图10a，b)。这些生态观察，加上我们使用简化微观世界的结果，加强了Variovorax作为细菌-细菌-植物通信网络中关键角色的重要性，这是在复杂的生化生态系统中维持根生长所必需的。
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