【新知解读】片段大小的分析有助于提高ctDNA监测灵敏度

  • 文章的主要创新在于研究方法、统计分析手段和思路。且研究工作全面，建立ctDNA片段特征图谱，无需先对体细胞进行检测，便可帮助确定血浆中ctDNA的存在与含量。且在全基因组和泛癌范围内鉴定了突变和非突变DNA的大小差异。

  • 利用cfDNA片段特征分析可以增加ctDNA检测评估敏感性。

  • 得出大多癌症类型的ctDNA的小于167bp，部分大于167bp，主要集中在250~320bp间的研究结论。关于大于167bp部分ctDNA来源尚不清楚，提高对其认知具有重要意义。

  • 筛选血浆样本中DNA片段能够富集样本中ctDNA含量，检出更多突变类型。

ctDNA是来自肿瘤基因组的碎片，其在癌症诊疗中的作用不言而喻。现有的检测ctDNA的方法主要关注于基因组的改变，但很少考虑血浆cfDNA的生物学特性。

目前提高ctDNA敏感性方法主要是通过提高测序深度，但会伴随着错误变异的检出。然而，只关注基因组突变的方法不能利用染色质组织或ctDNA片段大小的潜在差异，而且只加深测序深度很容易检出许多来自非癌细胞的假阳性突变。

与血浆中背景DNA片段对比，ctDNA大多具有片段较短的特征。片段大小分析和特定片段大小的选择性测序可以增加ctDNA检测敏感性，补充或替代cfDNA的深度测序方法。

1、肿瘤患者cfDNA片段大小特征研究

作者利用通过检测来自200名患有18种不同癌症患者的344份血浆样本以及来自健康对照组的65份血浆样本，以生成肿瘤cfDNA片段特征图谱。

图1 血浆DNA片段特征研究方案

注：通过对血浆样本进行双端测序可确定cfDNA的片段大小以及反映其在核小体周围的组织情况。cfDNA通过各种方式被释放到血液循环中，每一种方式都会在DNA片段的大小差异上留下标记。作者通过sWGS分析推断cfDNA的大小分布图谱(n=来自65名健康对照组和200名癌症患者组的344份血浆样本)，并通过个性化捕获测序得到突变体ctDNA的大小分布图谱(n=19份血浆样本)

图2 cfDNA片段大小分布

结果显示，癌症患者与健康个体的cfDNA分别在90~150 bp, 180~220 bp, 250~320 bp区域的分布均有所差异。健康个体血浆和晚期胶质瘤、肾癌、胰腺癌和膀胱癌患者血浆的cfDNA片段大小明显长于晚期乳腺癌、卵巢癌、肺癌、黑色素瘤、结直肠和胆管癌患者血浆的cfDNA。作者根据cfDNA片段在20 ~ 150 bp大小范围内的比例对18种癌症类型进行排序结果如图4。

图3 低于150 bp的cfDNA片段比例

图4 不同肿瘤类型低于150 bp的cfDNA片段比例

2、检测突变ctDNA片段大小

作者使用两种高特异性方法测定了血浆中突变ctDNA的大小（图5）。首先，从携带人类卵巢癌异种移植的小鼠血浆中，通过sWGS推断ctDNA和非肿瘤cfDNA的特异性大小图谱（图5）。结果如图6，ctDNA从小于167bp有一个变化（增多）。

图5 突变ctDNA片段大小研究方案

图6  片大小分布

注：携带人类卵巢癌异种移植的小鼠血浆中提取DNA的片段大小分布图谱，红色表示ctDNA，蓝色表示非肿瘤的cfDNA。两条垂直虚线指示145和167bp。

其次，测定19名癌症患者血浆中突变ctDNA的大小分布，结果如图7，携带突变等位基因的DNA片段富集在比核糖体DNA短20 ~ 40bp的片段中。突变体的ctDNA主要富集在90~150 bp和250~320bp之间。

图7  突变DNA和非突变DNA的大小分布

3、体外筛选肿瘤来源DNA片段

作者利用35例高级别浆液性卵巢癌患者的48份血浆样本中确定了使用台式微流控装置和sWGS在体外选择大小的短片段选择性测序的可行性。结果显示在血浆中选择短的DNA片段可以在全基因组范围内富集肿瘤DNA的含量。

图8  体外筛选DNA片段结果

注：绿色指示筛选前片段分布，蓝色指示使用硅胶（in silico）筛选后片段分布，橙色指示in vitro筛选后片段大小分布。

图9  HGSOC患者样本体外DNA片段选择的检测结果

注：A代表治疗前在血浆cfDNA中鉴定出SCNAs（ctDNA浓度较高），B代表在化疗开始3周后采集的血浆样本中，只观察到少量的局灶性SCNAs，以及C代表经片段筛选处理富集ctDNA后，能观察到未经处理B组观察不到的SCNAs。

4、量化体外筛DNA片段对检测结果影响

图10  突变等位基因 (MAF)与t-MAD相关性

如图10结果显示，对于t-MAD大于检测阈值(0.015)或MAF> 0.025的样本，观察到t-MAD与MAF之间存在较高的相关性(r = 0.80)。t-MAD是用来衡量片段筛选后，ctDNA的富集程度。

5、体外筛DNA片段对检测结果影响

图12   对比是否经过体外筛选处理样本对检测结果影响

经过体外筛选片段，t-MAD值提高（图12A）。经过体外筛选片段处理样本，肿瘤分子比率提高（图12B）。经过体外筛选片段处理样本，能检出比未经过体外筛选片段处理更多的 SCNAs（图12C），包括NF1、TERT、MYC等关键肿瘤基因的扩增。

图13  通过片段大小选择提高WES对多种癌症类型体细胞改变的检测

两种片段筛选方法（in vitro sizeselection，in silico size selection），均能起到富集肿瘤分子作用（图13A）。与没有经过片段筛选处理样本相比，使用两种方法（in vitro sizeselection，in silico size selection）筛选片段可以使WES检测到的突变数量平均增加53%，没有经过筛选片段处理能检出10232个突变，in vitro size selection处理后多检出260个突变，in silico size selection处理后多检出310个突变（图13B）。经过in silico size selection处理，几乎所有突变均得到富集（2133中的2061个，97%），平均增加1.7倍（图13C）。经过in silico size selection处理后，16名患者中的13名均检出额外突变。而在这82个额外突变中，23(28%)被证实存在于匹配的肿瘤组织DNA中，其中包括BRAF、ARID1A和NF1等关键癌症基因的突变（图13D）。

6、通过机器学习整合片段特征分析和体细胞突变分析来检测癌信号

图14  通过整合SCNAs和片段大小特征分析以增强ctDNA检测敏感度

本研究定义了cfDNA片段大小分布特征，包括：①不同大小范围内片段比例；②不同片段大小的比例；③不同片段大小浓度的振幅范围（图14A）。

使用来自t-MAD评分和片段特性分析的数据来进行PCA分析，显示健康样本和癌症患者样本之间的存在分离，结果还显示PCA分析与t-MAD评分结果具有一致性（图14B）。

cfDNA片段特征分析增强血浆中肿瘤DNA检测的潜力（图14C-F）。

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