过表达载体的构建方法及步骤

一、载体的选择及如何阅读质粒图谱目前，载体主要有病毒和非病毒两大类,其中质粒 DNA 是一种新的非病毒转基因载体。一个合格质粒的组成要素：（1）复制起始位点 Ori 即控制复制起始的位点。原核生物 DNA 分子中只有一个复制起始点。而真核生物 DNA 分子有多个复制起始位点。（2）抗生素抗性基因 可以便于加以检测，如 Amp+ ,Kan+（3）多克隆位点 MCS 克隆携带外源基因片段（4） P/E 启动子/增强子（5）Terms 终止信号（6）加 poly（A）信号 可以起到稳定 mRNA 作用选择载体主要依据构建的目的，同时要考虑载体中应有合适的限制酶切位点。如果构建的目的是要表达一个特定的基因，则要选择合适的表达载体。载体选择主要考虑下述3点：【1】构建 DNA 重组体的目的，克隆扩增/基因表达，选择合适的克隆载体/表达载体。【2】.载体的类型：（1）克隆载体的克隆能力－据克隆片段大小（大选大，小选小 ） 。如<10kb 选质粒。（2）表达载体据受体细胞类型－原核/真核/穿梭，E.coli/哺乳类细胞表达载体。（3） 对原核表达载体应该注意： 选择合适的启动子及相应的受体菌， 用于表达真核蛋白质时注意克服4个困难和阅读框错位；表达天然蛋白质或融合蛋白作为相应载体的参考。【3】载体 MCS 中的酶切位点数与组成方向因载体不同而异，适应目的基因与载体易于链接 ， 不能产生阅读框架错位。综上所述，选用质粒（最常用）做载体的5点要求：（1）选分子量小的质粒，即小载体（1－1.5kb）→不易损坏，在细菌里面拷贝数也多（也有大载体） ；（2）一般使用松弛型质粒在细菌里扩增不受约束，一般 10个以上的拷贝，而严谨型质粒<10个。（3）必需具备一个以上的酶切位点，有选择的余地；（4）必需有易检测的标记，多是抗生素的抗性基因，不特指多位 Ampr（试一试） 。（5）满足自己的实验需求，是否需要包装病毒，是否需要加入荧光标记，是否需要加入标签蛋白，是否需要真核抗性（如Puro、G418）等等。无论选用哪种载体， 首先都要获得载体分子， 然后采用适当的限制酶将载体 DNA 进行切割， 获得线性载体分子，以便于与目的基因片段进行连接。如何阅读质粒图谱第一步：首先看 Ori 的位置，了解质粒的类型（原核/真核/穿梭质粒）第二步：再看筛选标记，如抗性，决定使用什么筛选标记。（1）Ampr 水解β－内酰胺环，解除氨苄的毒性。（2）tetr 可以阻止四环素进入细胞。（3）camr 生成氯霉素羟乙酰基衍生物，使之失去毒性。（4）neor（kanr） 氨基糖苷磷酸转移酶 使 G418（长那霉素衍生物）失活（5）hygr 使潮霉素β失活。第三步：看多克隆位点（MCS） 。它具有多个限制酶的单一切点。便于外源基因的插入。如果在这些酶切位点以外有外源基因的插入，会导致某种标志基因的失活，而便于筛选。决定能不能放目的基因以及如何放置目的基因。第四步：再看外源 DNA 插入片段大小。质粒一般只能容纳小于10Kb 的外源 DNA 片段。一般来说，外源 DNA 片段越长，越难插入，越不稳定，转化效率越低。第五步：是否含有表达系统元件，即启动子－核糖体结合位点－克隆位点－转录终止信号。这是用来区别克隆载体与表达载体。克隆载体中加入一些与表达调控有关的元件即成为表达载体。选用那种载体，还是要以实验目的为准绳。第六步：启动子－核糖体结合位点－克隆位点－转录终止信号（1）启动子－促进 DNA 转录的 DNA 序列，这个 DNA 区域常在基因或操纵子编码序列的上游，是 DNA 分子上可以与 RNApol 特异性结合并使之开始转录的部位，但启动子本身不被转录。（2） 增强子/沉默子－为真核基因组（包括真核病毒基因组）中的一种具有增强邻近基因转录过程的调控顺序。其作用与增强子所在的位置或方向无关。即在所调控基因上游或下游均可发挥作用。/沉默子－负增强子，负调控序列。（3）核糖体结合位点/起始密码/SD 序列（Rbs/AGU/SDs） ：mRNA 有核糖体的两个结合位点，对于原核而言是 AUG（起始密码）和 SD 序列。（4） 转录终止序列（终止子）/翻译终止密码子：结构基因的最后一个外显子中有一个 AATAAA的保守序列，此位点 down－stream 有一段 GT 或 T 富丰区，这2部分共同构成 poly（A）加尾信号。结构基因的最后一个外显子中有一个 AATAAA 的保守序列，此位点 down－stream 有一段GT 或 T 富丰区，这2部分共同构成 poly（A）加尾信号。质粒图谱上有的箭头顺时针有的箭头逆时针， 那其实是代表两条 DNA 链， 即质粒是环状双链DNA，它的启动子等在其中一条链上，而它的抗性基因在另一条链上 .根据表达宿主不同，构建时所选择的载体也会不同。二、目的基因的获得一般来说，目的基因的获得有三种途径：调取基因：根据目的基因的序列，设计引物从含有目的基因的cDNA中通过PCR的方法调取目的基因，链接到克隆载体挑取单克隆进行测序，以获得想要的基因片段，这种方法相对成本较低，但是调取到的基因往往含有突变，还有不同基因的表达丰度不同，转录本比较复杂，或是基因片段很长，这些情况都很难调取到目的基因。全基因合成：根据目的基因的DNA序列，直接设计合成目的基因。此方法准确性高，相对成本会高一些，个人操作比较困难，需要专业的合成公司完成。优点是可以合成难调取及人工改造的任何基因序列，同时可以进行密码子优化，提高目的基因在宿主内的表达量。三、克隆构建目前，克隆构建的方法多种多样，除了应用广泛的酶切链接以外，现在还有很多不依赖酶切位点的克隆构建方式。下面具体说一下双酶切方法构建载体的步骤。实验材料实验试剂试剂名称生产厂家载体pCDNA3.1Transheep大肠杆菌菌株DH5αTiangen限制性内切酶FermentasT4连接酶Fermentas质粒DNA小,大量抽提试剂盒Axygen凝胶回收试剂盒Axygen琼脂糖BiowestDNA ladderFermentas（2）X基因慢病毒载体的构建X基因 基因由Transheep全基因合成，构建于载体PUC57中。PUC57-X基因 EcoRI/BamHI酶切结果：

Lane1：GeneRay 1kb DNA Ladder (从上至下依次为：3000bp, 2000bp, 1500bp, 1000bp,  500bp, 250bp,100bp)Lane2：PUC57-Neurod1 EcoRI/BamHI酶切产物酶切完成后进行胶回收2. 载体用pCDNA3.1双酶切，酶切体系如下。20ul酶切体系    37度3小时4ul          pCDNA3.1载体（500 ng/ul）1ul          BamHI1ul          EcoRI2ul          10×buffer12 ul        H2O酶切完成后胶回收（见附录）

Lane1：GeneRay 1kb DNA Ladder (从上至下依次为：12000bp, 8000bp, 6000bp, 5000bp, 4000bp, 3000bp, 2500bp, 2000bp, 1500bp, 1000bp, 750bp, 500bp, 250bp)Lane2： pcDNA3.1载体酶切回收产物处理好的目的片段与载体连接反应体系：6ul         PCR 酶切回收片段（约50ng/ul）1ul         酶切好的载体（约50ng/ul）2ul         ligase buffer1ul         T4ligase10ul         H2O以上连接液在16℃过夜。转化 (感受态细胞: DH5a),具体步骤见附录转化部分。抗性: Amp; 37℃，培养过夜转化后X基因分别平板挑菌, 37℃ 250转/分钟摇菌14小时，PCR鉴定后，将阳性菌液送上海权阳生物技术有限公司测序。X基因 慢病毒载体单克隆菌落PCR鉴定（使用载体通用引物,PCR条带大小应比实际大200bp左右）：

Lane1：GeneRay 1kb DNA Ladder  (从上至下依次为：2000bp, 1500bp, 1000bp, 750bp, 500bp, 250bp,100bp)Lane2-4： X基因 菌落鉴定PCR产物