科研 | Nat. Commun.：蛋白质组溶解度与热稳定性分析揭示了ATP的独特调节作用
编译：东方不赢，编辑：Emma、江舜尧。
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三磷酸核苷酸（NTPs）调节细胞中许多生物化学进程，例如（共）底物，变构调节剂，生物合成前体和信号分子1,2,3。细胞中最丰富的NTP，三磷酸腺苷（ATP）由于其作为促进细胞生物化学反应的能量来源以及蛋白质磷酸化必不可少的调节分子的作用，受到了充分的研究。除了这些常规作用外，有研究表明ATP还影响大分子组装，例如蛋白质复合物和无膜细胞器。 NTP含量第二高的三磷酸鸟苷（GTP）因其在细胞信号传导和细胞内转运中的调节作用而受到广泛研究。最近，已证明ATP和GTP均可溶解蛋白质聚集体，并可能具有水溶助长剂的功能。但是，缺乏在接近天然细胞环境的条件下来进行NTP相互作用的全系统表型研究限制了对NTP多种生理作用的认识。
大多数蛋白质代谢物之间的相互作用是微弱的和短暂的，因此很难在系统内捕获。最近，最新的蛋白质组的研究结合了配体融合的生物物理特征和质谱分析，提高了对细菌和哺乳动物细胞的提取物中蛋白质-代谢物相互作用的理解，但主要限于可溶性蛋白质组。
本研究通过评估蛋白质在机械破坏细胞中的热稳定性和蛋白质溶解度度来映射和量化蛋白质组范围内的NTP相互作用，本实验条件与细胞环境更相似。其结果揭示了ATP的不同生物学作用具体取决于其浓度。观察到ATP与浓度低于500µM的蛋白质特异性相互作用，而ATP在稍高浓度（1-2 µmM）才会用作底物或变构调节剂影响蛋白质复合物的蛋白质-蛋白质相互作用。在高浓度（> 2 mM）下，ATP调节1/4不溶蛋白质组的溶解状态，该蛋白质组由带正电荷的，内在无序的核酸结合蛋白组成，是无膜细胞器的一部分。增溶的程度取决于蛋白质在不同的无膜细胞器中的定位。此外，研究揭示了ATP在调节屏障对自身整合因子（BANF1）在蛋白质-DNA相互作用中的作用。这研究的数据提供了ATP影响蛋白质结构以及蛋白质复合物稳定性和溶解性的蛋白质组定量图谱，提供了其在蛋白质相变中作用的独特线索。
论文ID
实验设计
实验结果
1. NTP-蛋白质相互作用亲和力热稳定性图谱
研究者机械破坏了Jurkat细胞，以获得保留了不溶性蛋白质，蛋白质缩合物和嵌入脂质的膜蛋白的粗裂解物。这些裂解物中通过结热蛋白质组分析（TPP）的方法可监控蛋白质在使用单一NTP浓度处理或超过一定浓度范围（二维（2D）-TPP）以确定改变蛋白质热稳定性所需的NTP量的溶解曲线（图1a）。
图1 ATP和GTP对蛋白质组热稳定性的影响
a 使用粗裂解物系统的2D热蛋白质组分析（2D-TPP）的实验装置。b 热图显示了与未经处理的粗裂解物（每幅图的第一列）相比，用不同温度ATP处理时蛋白质丰度随温度升高的相对倍数变化（FC）。c 热图显示与未处理的粗裂解物（每幅图的第一列）相比，用不同浓度GTP处理后蛋白质丰度的相对FC随着温度的升高而变化。d，e在由ATP（d）和GTP（e）稳定的UniProt中注释的不同类别蛋白质的-log10半最大有效浓度（pEC50）值的分布。f ATP影响蛋白酶体稳定性的网络图g稳定的ATP结合复合物亚基和非稳定的非ATP结合亚基的熔解曲线之间的欧几里得距离比较（左），以及稳定的ATP结合复合物亚基和稳定的非ATP结合亚基（右）之间的欧氏距离不同的复合体。
TPP实验表明，粗裂解物和凝胶过滤的裂解物的熔点变化相似，证实了粗裂解物是检测蛋白质-代谢物相互作用的合适系统。细胞内ATP的浓度在细胞中（1-10 mM）高度可变，GTP的水平比ATP低约五倍。研究者而发现在粗裂解物中2 mM ATP和0.5 mM GTP诱导的熔点变化分别对已知的ATP和GTP结合蛋白具有选择性，并用作剂量依赖性的最大浓度2D-TPP研究（图1a–c）。2D-TPP分析从7549个已鉴定的蛋白质中发现了753种在ATP存在下热稳定性增强的蛋白质，确定了NTP与蛋白质的亲和力，为蛋白质稳定作用的最大有效浓度的一半。由ATP调节稳定性的蛋白质组是带ATP结合蛋白是被最大影响的，一部分GTP结合蛋白还显示出ATP增加的热稳定性（图1d）。而且，ATP降低了151种蛋白质的热稳定性，这些蛋白质富含RNA结合蛋白，包括核糖体蛋白。
2D-TPP实验表明，粗裂解物中已鉴定7618种蛋白质中的256种热稳定性提高了，其中大部分属于GTP-（102个蛋白）和ATP-（103个蛋白）结合蛋白（图1e），只有九种蛋白质显示较低的热稳定性。包含磷酸结合环（P环）的蛋白质可通过ATP或GTP稳定化。与ATP稳定蛋白相比，Walker-A基序侧翼的残基在GTP稳定蛋白中的组成受到了更大的限制。两种NTP都能稳定的蛋白质包括小部分激酶和带有P环的蛋白质（AAA型ATP酶和小GTP酶）。这些蛋白中很多可以与代谢产物相互作用，其中有一些未报道过的具有这种特性的蛋白质，例如ATP结合盒超家族蛋白（ABCE1，ABCF1），酪蛋白水解肽酶B蛋白同源物（CLPB），酪氨酸蛋白激酶（CSK）等。总之，实验证明了ATP和GTP诱导的热稳定之间的交联作用，确认了已知的ATP / GTP结合蛋白并发现了潜在的新蛋白，并表明ATP和GTP结合偏好反映了Walker-A上的不同序列限制侧翼残基的基序。
与大肠杆菌系统研究结果相似，在UniProt中超过一半的受ATP影响的蛋白质未标注为ATP或GTP结合剂。这些蛋白质需要较高的ATP浓度才能稳定（图1d）。研究者观察到了几种NADH脱氢酶的热稳定性，之前研究表明它们被ATP抑制。这说明细胞中较高的ATP水平可能导致这些酶的反馈抑制。研究者还观察到非ATP结合亚基的优先稳定化作用，该亚基与至少一个ATP结合亚基形成复合物。这表明ATP结合复合物亚基的热稳定可以传播到近端非ATP结合亚基。蛋白酶体提供了一个具体例子，19 S调节颗粒中的ATP结合PSMC亚基，大多数非ATP结合PSMD亚基也被ATP稳定了。相反，没有ATP结合亚基的20S核心颗粒的热稳定性没有改变。通过比较蛋白质的解链曲线，观察到19S和20S亚基均表现出显着的颗粒之间共融行为，表明ATP诱导的稳定化传播仅适用于物理上接近的亚基（图1f）。这种非ATP结合亚基和ATP结合亚基的相似融解的特点是ATP诱导的复合物稳定的普遍特征。
2. ATP相互作用物组最重要特征：细胞中的ATP减少
通过使抑制糖酵解和氧化磷酸化过程降低细胞中的ATP水平，并比较了TPP实验中对未处理的，和ATP耗尽的细胞的热稳定性曲线（图2a），来观察结果是否与细胞完整性有关。上述处理会导致Jurkat细胞ATP水平降至未处理细胞的〜10％。ATP结合蛋白表现出最明显的热失稳作用（图2b）。同样，裂解液中由ATP稳定的蛋白质复合物亚基在ATP耗尽的细胞中也不稳定（图2c）。具体而言，以26S蛋白酶体为例，与20S亚复合物相比，19S调节粒子在ATP耗尽时表现出明显的去稳定作用，从而证实了复合物热稳定性传播是基于它们与配体结合亚基的相似性（图2d）。最后，裂解液中被ATP破坏的蛋白质在细胞ATP耗尽后显示出显着的热稳定性。
图2 ATP消耗对蛋白质组热稳定性的影响
a 在未经处理的细胞（蓝色表示）和ATP消耗的细胞的TPP实验设计。b当细胞中的ATP耗尽后，粗裂解物实验中非ATP结合蛋白，ATP结合蛋白和ATP稳定的ATP结合蛋白的融点中位数变化。c 在粗裂解物实验中，由ATP稳定的蛋白质复合物亚基的融点变化（右）；在细胞中ATP耗尽后，所有其他蛋白质的熔点变化（左）。d 细胞中ATP耗尽后19S和20S蛋白酶体亚基以及所有其他蛋白质的融点变化。
3. ATP可促进溶解了部分不溶性蛋白质组
2D-TPP实验显示几种蛋白质在42°C下随较高的ATP和GTP浓度而明显增加（例如LUC7L，图1b，c）。这表明增加了溶解度而不是热稳定的，并支持了近期发现的ATP可作为生物水溶助长剂的功能观点，该功能可溶解水溶液中的疏水分子。利用溶解度蛋白质组分析（SPP）系统地评估ATP在蛋白质组溶解度中的作用，该方法使用多重质谱分析来量化蛋白质组范围内分子的浓度依赖性效应在单个可溶和不可溶蛋白群体上（图3a）。采用Mg-ATP进行SPP实验，将粗制细胞裂解液分为10等分，其中9种分别用溶媒或递增浓度的ATP处理，然后用温和的去污剂NP40溶解膜或细胞器结合蛋白，用强洗涤剂SDS（1％）溶解第十份试样。为每种蛋白质确定的SDS和NP40溶解样品之间的比率说明存在于不溶或可溶状态的馏分比例，其中较高的比率表明较高的不溶比例。通过确定最大溶解浓度（EC50）来显示了ATP溶解蛋白质的敏感度。
图3 可溶性蛋白质组图谱表显了ATP对蛋白质组的广泛溶解作用
a 可溶性蛋白质组图谱表征了ATP对蛋白质组的广泛溶解作用。b 蛋白质组溶解度的热图。c ATP（上图）和非水解ATP（AMP-PNP）（下图）处理后，BANF1，DDX50和FBL的溶解度曲线。d 不同无膜细胞器的ATP溶解蛋白的-log10一半最大有效浓度（pEC50,s）值的分布。f（从SPP数据获得）通过TPP测量的由ATP溶解的蛋白质，与所有其他蛋白质相比，在10 µmM ATP和溶媒处理的粗裂解液中的融点差异。
为了研究ATP作为生物水溶助长剂的作用如何影响单个蛋白质的溶解性，研究者检查了不溶性蛋白质组。与NP40处理的载体条件相比，在SDS处理的载体条件下至少富集50％的蛋白质被定义为不溶性蛋白质组。这些蛋白质中的大多数都有一个可溶性亚群（图3b）。观察到在实验中被鉴定为不溶的760种蛋白质中188种蛋白质的ATP依赖性增溶，并计算了这些蛋白质的剂量依赖性增溶的EC50（图3b，补充数据5）。这些数据表明，ATP可溶解几乎25％的不溶蛋白质组。有趣的是，只有23％的可溶蛋白被标注为ATP结合物，而大多数（54％）被标注为无膜细胞器的一部分。此外发现蛋白质对溶解表现出不同的敏感性。例如，肌球蛋白（MYO1G）等蛋白在存在ATP36，BANF1和DDX50的情况下会从肌动蛋白上解离，而ATP可通过亚微摩尔EC50,s有效地溶解，而其他蛋白仅在更高的ATP浓度下溶解（图3c）。令人惊讶的是，蛋白质被ATP溶解的敏感性主要取决于它们在不同的无膜细胞器中的定位。例如，注释为一部分核斑点的蛋白比注释为核仁的蛋白的可溶ATP浓度更低（图3d）。通常，ATP增溶的蛋白质在无序区域显着富集，并且等电点显着高于其余蛋白质组（图3e）。这些溶解度影响与在10μmMMgCl2处理过的样品中观察到的显着不同，表明ATP诱导的溶解度变化主要不是盐驱动的（补充图6E）。但是，GTP以及ATP的非水解类似物（AMP-PNP）模仿了ATP的增溶特性。这些观察结果表明，ATP水解不是ATP介导的增溶作用的主要因素。
此外，使用TPP研究了10 mMATP的添加如何影响可溶蛋白的热稳定性（补充数据8），并观察到与溶媒相比，热不稳定的趋势很明显（图3f）。这表明这些蛋白的ATP溶解的成分往往比可溶性蛋白具有更低的热稳定性，这可能是由于两种蛋白之间存在明显的相互作用或翻译后修饰。
4. 细胞中ATP的耗尽会降低蛋白质的溶解度
实验者使用2-脱氧葡萄糖和抗霉素A消除了Jurkat细胞中的ATP来继续对可溶度的分析（图4a）。与溶媒条件相比，在ATP耗尽的细胞中鉴定出107种蛋白质的溶解度降低（。如前所述，由于预计ATP耗竭会影响几个体内平衡过程，因要评估在粗裂解液系统中可溶蛋白质在细胞中的溶解度变化（图4a）。通常，在细胞裂解液中，以较低的ATP浓度溶解在粗裂解物中溶解度下降幅度更大（图4b）。例如，在较高的ATP浓度下溶解于粗裂解物中的FBL，在ATP耗尽后，在细胞中的溶解度没有降低（图4c）。相比之下，DDX50和BANF1，这两种蛋白质在粗裂解物中被低浓度的ATP溶解，在细胞中ATP耗尽后显示溶解度降低（图2i）。
图4 ATP耗尽的细胞的SPP实验显示在粗裂解物中的作用
a ATP耗尽细胞中SPP的实验。b 在细胞中ATP耗尽后，根据蛋白质在粗裂解物中的ATP溶解倾向（pEC50 x轴）计算出的溶解度变化。c 通过计算NP40处理的未处理和ATP耗尽条件的log2比值来测量细胞中ATP耗尽后FBL，DDX50和BANF1的溶解度变化。d 在ATP存在时BANF1的DNA有结合倾向。
5. ATP改变了BANF1的DNA结合
研究团队继续研究在高度ATP增溶的蛋白质之一“自整合因子的屏障”（BANF1）中观察到的溶解度变化，该蛋白质未注释为任何无膜细胞器的一部分。BANF1是一种非特异性的DNA结合蛋白，可瞬时交叉桥接染色体以促进单个核的组装。想验证ATP是否会影响其与DNA结合的能力，因此测试了纯化的BANF1）在存在和不存在ATP的情况下是否结合了双链DNA。结果观察到，随着ATP浓度的增加，BANF1与DNA相互作用的能力会降低（图4d）。2.5 mM ATP的存在使与DNA结合的BANF1的量减少了近50％（图4d）。这表明ATP通过阻止BANF1与DNA结合来增溶BANF1。
6. ATP降低了几种蛋白质的溶解度
在粗裂解物中，少量蛋白质随着ATP浓度的增加而变得不易溶解，其中两个突出的例子是IMPDH1和NUCKS1（图5a）。在这两种情况下，ATP水解都可能起作用，因为在添加不可水解的ATP类似物AMP-PNP后，两种蛋白质的溶解度均未降低。据报道，ATP可作为重组IMPDH1的变构调节剂，促进丝状结构的形成，这与对内源IMPDH1的观察一致。NUCKS1预计是高度无序的染色质相关蛋白（99％），这是通过同源重组修复DNA所必需的。NUCKS1的单核苷酸多态性已通过全基因组关联研究证明与帕金森氏症（一种与蛋白质聚集相关的疾病）有关。NUCKS1在用10μmMATP处理的TPP实验中的溶解遵循惊人的模式，可溶性蛋白丰度在〜58°C时急剧增加。在更高的温度下，观察到可溶性蛋白的温度依赖性降低，其溶解曲线与溶媒条件下的熔解曲线相匹配（图5b）。这表明ATP代谢可能诱导NUCKS1转变为两相，表现为蛋白质溶解度的损失。加热后，NUCKS1的组成单元在58°C时转变为单相，表明其临界温度转变。相反，IMPDH1在较低温度下的溶解度逐渐增加，并且热稳定性显着提高，表明ATP结合导致构象更稳定（图5b）。最后，研究者探究是否在生理条件下（不添加ATP）具有不溶性蛋白质在加热时是否会显示出溶解度一定的增加。研究者研究了整个加热温度的最大倍数变化（以37°C为参考计算），观察到在粗裂解物中具有不溶亚群的蛋白质的解链曲线，对于这组蛋白质，发现加热后可溶的蛋白质数量显着增加（图5c），表明蛋白质组水平上温度相关的相变。这些观察结果表明，热稳定性和溶解度的组合可潜在地用于表现系统范围内的相变。
图5 SPP识别添加ATP后溶解度降低的蛋白质
a IMPDH1和NUCKS1的溶解度曲线。b 来自两次独立的TPP实验的IMPDH1和NUCKS1溶解曲线。c在未处理的粗裂解物中，不溶与可溶蛋白的解链曲线观察到最大log2倍变化。
讨论
通过测量机械破坏细胞中蛋白质的热稳定性和溶解度，研究者得到了ATP蛋白质组范围内的整个调控格局实验中的TPP，2D-TPP和SPP数据一起显示了ATP的浓度依赖性作用。在低浓度（低于500μm）时，ATP主要充当核苷酸结合蛋白的底物。在中等浓度（1-2 µmM之间）时， ATP对蛋白质复合物稳定性的广泛影响。在较高浓度（大于2 µmM）下，ATP具有增溶作用，主要作用于带有正电荷的无序蛋白质，这些蛋白质结合核酸（DNA和RNA）（图6）。尽管ATP的高亲和力相互作用似乎是选择性的（除了一小部分ATPase，它们在ATP和GTP之间混杂），但ATP的低亲和力溶解度效果与等量的GTP相同。
图6 ATP的浓度依赖性蛋白质组效应
用2D-TPP和SPP技术测量的ATP稳定的ATP结合蛋白，复合物以及ATP溶解的蛋白的pEC50的密度图。尽管分布存在明显差异，但仍存在大量重叠，表明ATP浓度的变化将同时影响ATP结合蛋白和复合物的稳定性以及无序蛋白的溶解度。
从机械破坏的细胞中获得的裂解物使实验能够同时评估ATP对可溶性和不溶性蛋白质组的影响。SPP分析表明，ATP可溶解大部分不溶性蛋白质组，而该组富含无膜细胞器的成分。这些细胞器是大分子缩合物，是通过蛋白质和核酸之间弱相互作用而形成的，这种现象称为相位分离。先前的研究表明，主动利用ATP的过程可驱动其的调控。但是该研究数据表明，ATP不仅通过调节酶的活性，而且还通过直接促进此类缩合物的溶解来调节相分离。最近的报道表明，蛋白质序列中的长距离静电和短距离阳离子-π或π-π相互作用对于相位分离可能至关重要。ATP的芳族腺嘌呤环和高度带负电荷的磷酸酐键可能会破坏带正电荷的蛋白质中的π-π和静电相互作用，从而增加其溶解度。此外，与可溶的对应物相比，ATP溶解的蛋白质亚群显示出较低的热稳定性。这表明，尽管独立于ATP水解的机制可以溶解蛋白质，但可能需要适当的翻译后修饰以使其在可溶性状态下稳定。
ATP可能会影响蛋白质的核酸结合。BANF1非特异性结合DNA，是参与核组织的关键蛋白。据报道，BANF1的磷酸化可调节其DNA结合特性。但是，在粗裂解物实验中观察到ATP诱导的BANF1增溶现象，并且细胞中ATP耗尽后其溶解度急剧降低。此外，随着ATP剂量的增加，BANF1（重组纯化）的DNA结合组分减少，证明了ATP在调节非特异性核酸-蛋白质相互作用中的作用。这些观察结果表明，可以通过改变ATP水平来独立于磷酸化调节BANF1的溶解度。先前的研究表明，ATP耗竭会导致染色质变紧，研究者推测BANF1可能在低ATP水平下与染色质和紧密DNA相互作用。
综上所述，在蛋白质组水平上表现出的ATP依赖性表明，影响细胞中ATP浓度的代谢波动（例如营养缺乏）可能被认为是核酸结合蛋白溶解度状态的改变。这个实验的数据提出了一个假设，即细胞中ATP的水平可能直接影响蛋白质与核酸相互作用的动力学，这可能解释了细胞中转录和翻译速率的相应下降。该研究的数据提供了受ATP影响的子蛋白质组溶解度和热稳定性的独特图谱，并将有助于发现ATP结合蛋白，无膜细胞器的成分以及相分离的调节剂。文章所述的SPP方法可用于其他研究中，用来评估其他分子和细胞扰动对不同疾病相关细胞类型中蛋白质溶解度的影响，以研究对聚集敏感的蛋白质和细胞器的调控。