科研 | Horticulture Research：促进番茄果实成熟的一个新型NAC转录因子（国人佳作）
编译：Yong-qin，编辑：十九、江舜尧。
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番茄果实的成熟受内源激素、环境信号、转录因子的调控，这些因素组成了果实成熟的调控网络，其中转录调控在果实成熟过程中尤为重要，因此转录因子的靶基因的鉴定具有重要意义。早期对于果实成熟的转录调控研究主要根据突变体的表型，比如rin、Cnr基因。MADS-RIN被认为是番茄果实成熟的重要调控因子（转录因子），它存在于RIN和MC基因的间隔区域，同时影响植株的萼片发育和花序结构。
转录调控对于番茄果实的成熟有重要影响，其中NOR(no-ripening)基因是一个NAC家族转录因子，其对果实成熟的调控机制仍不清楚。研究表明，番茄基因组含有101个NAC转录因子，其中NOR、SlNAC1、SlNAC4均调控果实成熟过程，但其靶基因尚不清楚。本研究通过病毒诱导的基因沉默（VIGS）和基因编辑（CRISPR/Cas9）发现一个与调控番茄果实成熟的类NOR转录因子（NOR-like1），并发现它与乙烯生物合成、果色改变、细胞壁代谢等多个途径的基因的启动子结合，正向调控表达。
论文ID
原名：A NAC transcription factor, NOR-like1, is a new positive regulator of tomato fruit ripening
译名：促进番茄果实成熟的一个新型NAC转录因子
期刊：Horticulture Research（农林1区）
IF：3.640
发表时间：2018.12
通讯作者：傅达奇
通讯作者单位：中国农业大学食品科学与营养工程学院
DOI号：10.1038/s41438-018-0111-5
实验设计
① 植物材料。收集番茄（Solanum lycopersicum）不同成熟阶段的果皮组织，液氮冻存。NOR-like1-GFP进行亚细胞定位，qPCR确定NOR-like1表达模式。
② 基因沉默。病毒诱导的基因沉默（VIGS）由烟草脆裂病毒（TRV）介导；CRISPR/Cas9进行基因编辑。DNA片段测序及western blot进行突变分析。
③ RNA-seq。Illumina HiSeqPE150 150bp 双末端测序，TopHat进行短序列比对，DESeq2分析差异基因，进行GO富集分析。
④ 核酸蛋白互作鉴定。电泳迁移率变动分析EMSA；染色质免疫沉淀ChlP-qPCR分析；双荧光素酶系统分析。
结果
1、病毒介导NOR-like1沉默，延迟果实成熟
携带NOR-like1的TRV病毒对果实B+5时期的成熟有明显抑制作用（图1a），表明其参与了果实成熟调控。且qPCR表明NOR-like1在果皮绿色部分的转录水平明显较低（图1b）。
2、NOR-like1的定位和表达模式
NOR-like1:GFP融合蛋白的绿色荧光表明NOR-like1蛋白定位于细胞核内（图2a），qPCR表明在NOR-like1在根茎叶中低表达，在花和果实高表达，在MG时期开始高表达，破乳期达到表达峰值（图2b）。奇怪的是，NOR-like1不受外源乙烯和乙烯抑制剂1-MCP的影响（图2c）。这些结果表明NOR-like1对果实成熟其正调控作用，且对乙烯不敏感。
3、CRISPR-Cas9编辑NOR-like1，延果实成熟
CRISPR-Cas9共产生16个基因敲除株系，4个基因靶点如图3a。有2个株系成熟明显抑制（NOR-like1#1和NOR-like1#11），变异序列如图3b。使用蛋白质c端产生的特异性抗体进行western blot检测，表明突变株由于提前终止翻译而缺失NOR-like1蛋白（图3c）。表型分析同样证明NOR-like1基因沉默会延迟果实成熟。
4、NOR-like1突变对基因表达的影响
突变株的转录组与野生型相比，共筛选出4453个上调基因，2254个下调基因（图4a）。qPCR验证其中9个基因的表达保证了RNA-seq的可靠性R2=0.91（图4b）。GO富集分析表明NOR-like1主要影响了植株的木葡萄糖转移酶活性、叶绿素结合、细胞色素b6f活性、卟啉和萜类化合物生物合成（图4c）。结果表明，NOR-like1通过调控相关基因的转录，进而影响番茄果实的成熟。
5、NOR-like1与SlACS2/4启动子结合，调控乙烯合成
气相色谱检测果实发现nor-like1#1和nor-like1#11的乙烯含量减少了约一半（图5a）。qPCR表明SlACS2/4表达明显降低（图5b）。且使用外源乙烯处理突变体，仍无法促进果实完全成熟（图5c）。SlACS2/4启动子分析发现一个NAC转录因子的识别序列，电泳迁移率实验EMSA表明NOR-like1可特异性结合SlACS2/4启动子（图5d）。ChlP-qPCR表明NOR-like1可直接与SlACS2/4启动子结合（图5e），双荧光素酶分析证明NOR-like1与SlACS2/4共转染导致荧光值LUC/REN上升（图5f）。综上，NOR-like1激活SlACS2/4启动子活性，起正调控作用，促进番茄果实乙烯的生物合成。
图5 NOR-like1与SlACS2/4启动子的互作。
6、NOR-like1正向调控SlGgpps2、SlSGR1，调节果实颜色变化
测定突变株与野生型的类胡萝卜素，发现β-胡萝卜素和番茄红素的含量显著降低（图6a），而叶绿素含量较高（图6b），qPCR表明突变株SlGgpps2、SlSGR1的表达明显受到抑制（图6c）。EMSA（图6d）、ChIP-qPCR（图6e）、双荧光素酶分析（图6f）证明NOR-like1可结合SlGgpps2、SlSGR1启动子区域，并激活其表达。
图6 NOR-like1与SlGgpps2、SlSGR1的互作。
7、NOR-like1调控SlPG2a、SlPL、SlCEL2、lEXP1，影响果实硬度
质构分析仪发现突变株果实硬度显著较高（图7a）。透射电镜显示突变株细胞壁颜色较深，即微丝排列更紧密，表明细胞壁降解受到抑制（图7b）。细胞壁代谢相关的4个基因SlPG2a、SlPL、SlCEL2、lEXP1的表达均下调（图7c），EMSA（图7d）、ChIP-qPCR（图7e）、双荧光素酶分析（图7f）均证明NOR-like1对SlPG2a、SlPL、SlCEL2、lEXP1的调控作用。
图7 NOR-like1与SlPG2a、SlPL、SlCEL2、lEXP1的互作。
讨论
本研究发现NOR-like1与果实成熟调控因子NOR基因有62.84%的氨基酸序列同源性，它们共同隶属NAC家族转录因子系统发育树的一个分支。尽管如此，NOR-like1和NOR突变体的表型是不一样的，NOR突变体果实不产生乙烯，且一直保持绿色，而NOR-like1突变体表现明显的成熟延迟，但是果实可以产生乙烯和类胡萝卜素，果实成熟后显橙红色。此外，NOR-like1突变体果实的种子发育存在缺陷，而NOR突变体果实能产生正常的种子。先前有研究表明NOR-like1-RNAi干扰会抑制种子发育，在拟南芥中种子发育受两个同源基因NARS1和NARS2的影响，这两个基因的与NOR和NOR-like1有密切的进化关系，但是在番茄中NOR基因并不能抑制种子发育。这些结果表明这两个基因具有同源性，但功能上有区别。
从生理学上，番茄果实属于跃变型果实，在成熟阶段开始时有显著的呼吸作用和乙烯产生。乙烯的调控与ACC合酶基因SlACS1A、SlACS2、SlACS4的表达相关，其中SlACS2起主要诱导作用，而SlACS2和SlACS4都收到发育信号的调控。此外ACC氧化酶基因SlACO1、SlACO3也调控乙烯的产生，其受果实成熟相关的转录因子调控。先前研究表明RIN和TAGL1和FUL1/FUL2形成配合物，调节SlACS2和SlACS4的表达，我们研究补充了NOR-like1也可以调控SlACS2和SlACS4的表达。这表明RIN和NOR-like1同时调控着ACC合酶的产生，但RIN和NOR-like1之间的相互作用则有待研究。同时，本研究发现用外源乙烯乙烯或1-MCP处理对NOR-like1的转录水平无影响，因此NOR-like1可作用于乙烯生物合成基因，但不参与乙烯信号转导途径。此外，NOR-like1的突变不仅仅影响了果实的乙烯合成，因此外源乙烯的处理不能使突变株完全恢复成熟状态，果实无法完全变红，同时说明其在果实颜色发育起作用。这些结论表明乙烯的生物合成由复杂的转录因子共同调控。
成熟的番茄果实的颜色由番茄红素的积累和叶绿素的降解共同决定，从而导致颜色变化，这些也被作为果实成熟程度和整体质量的指标。在高等植物中，类胡萝卜素由异戊二烯焦磷酸（IPP）合成，受IPP异构酶和GGPP合酶的催化。在NOR-like1突变体中，涉及类胡萝卜素生物合成的部分基因（DXS、Ggpps2、PSY1、PSY2）表达下调，故而导致果实无法呈现橙红色的表型，且互作分析也发现，NOR-like1可以与Ggpps2的启动子结合，对表达正向调控。研究表明SlSGR1基因在叶片和果实的叶绿素降解中起重要作用，SlSGR1可以与类胡萝卜素合成酶作用调节番茄红素的积累，抑制其活性。这些结论表明，NOR-like1通过调控类胡萝卜素积累（SlGgpps2）和叶绿素降解（SlSGR1）来控制果实的颜色。
综上，本研究发现一个与果实成熟调控因子NOR基因具有同源性的NAC类转录因子基因，并命名为NOR-like1。NOR-like1正向调控乙烯生物合成基因SlACS2/4的表达，且不受外源乙烯影响，进而控制果实成熟；NOR-like1正向调控类胡萝卜素生物合成基因SlGgpps2和叶绿素降解基因SlSGR1表达，控制果实颜色；NOR-like1正向调控果胶溶解基因SlPG2a/SlPL和细胞壁解体基因SlCEL2和细胞壁松弛因子lEXP1的表达，控制果实软化（图8）。
评论
本研究发现NOR-like1基因沉默导致番茄果实成熟的延迟这一表型，进而探究其分子机制。生理生化上该基因影响乙烯、叶绿素、类胡萝卜素含量；基因水平上该基因调控乙烯生物合成、细胞壁代谢、果色形成相关基因。研究结果表明，NOR-like1是一种新发现的番茄果实成熟的转录调控因子，在果实发育起重要作用。
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