编译：艾奥里亚，编辑：景行、江舜尧。
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导读
背景：人类世时期（The Anthropocene epoch）与金属在环境中的扩散有关，这增加了其对生物体的氧化和遗传毒性。有趣的是，在金属土壤中生长的约520种植物的枝条中具有很强的富集和耐受镍的能力。这些物种大量的系统发育分布表明，镍的超富集是多次独立进化的结果。然而，这些机制的真实特点以及它们在远谱系物种是否具有一致性尚不清楚。目的：为了解决这些问题，本研究开发了一种结合差异基因表达分析和同源聚类注释的跨物种RNA-seq方法来探究与远亲植物家族中镍的过度积累相关的基因变化。结果：研究揭示分析了编码聚合功能的候选同源基因，这些基因涉及包括特殊代谢物和细胞壁组织的生物合成在内的镍的超富集。此外，本研究结果还表明，IREG/铁转运蛋白的高表达是参与植物镍富集的一种机制。研究进一步分析了镍富集植物Noccaea caerulescens中NcIREG2转运蛋白在液泡镍固存中的作用，为遗传学提供了证据。结论：研究结果为更好地理解植物中的镍超富集机制和研究其进化提供了分子工具。
原名：Wide cross-species RNA-Seq comparison reveals convergent molecular mechanisms involved in nickel hyperaccumulation across dicotyledons
译名：跨物种RNA-seq比较揭示了在双子叶细胞中镍超富集的分子机制
期刊：New Phytologist
IF：8.512
发表时间：2020年6月
通讯作者：Sylvain Merlot
通讯作者单位：巴黎-萨克雷大学（Université Paris-Saclay）
DOI号：10.1111/nph.16775
本研究采集了5个镍超富集的不同植物的植物叶片，这其中包括Brassicaceae科的N. caerulescens ssp. firmiensis （Ncfi），Cunoniaceae科中的Geissois pruinosa （Gpru），Euphorbiaceae科中的Leucocroton havanensis （Lhav），Rubiaceae科中的Psychotria costivenia （Pcos），Psychotria gabriella （Pgab）和Psychotria grandis （Pgra），Salicaceae科中的Homalium kanaliense （Hkan）以及非镍富集植物的叶片，包括Brassicaceae科的N. caerulescens 'Viviez’ （Ncviv），Noccaea montana （Nmon），Cunoniaceae科的Geissois racemosa （Grac），Euphorbiaceae科的Lasiocroton microphyllus （Lmic），Rubiaceae科的Psychotria revoluta （Prev）, Psychotria semperflorens （Psem）以及Salicaceae科的Homalium betulifolium （Hbet），所有采集的植物叶片均在自然环境中生长，采集时采用GPS进行定位。对于每个样品，一部分叶子经水洗涤后干燥，随后进行元素分析，另一部分在现场混合液氮并在4°C环境下保存，用于后续RNA提取及分子生物学分析。
镍超富集植物以草本植物、灌木或乔木的形式分布在50个植物科中，几乎完全分布在双子叶植物中（45个科），在Rosids和Asteridas分支中都有被检测到（图1）。包括Brassicaceae（87个分类群），Asteraceae（45个分类群）以及COM 进化分支家族（Cunoniaceae（48个分类群）、Euphorbiaceae （42个分类群），Salicaceae （38个分类群））在内的科属属于镍超富集植物。这些植物的分布表明，这一复杂的性状在植物进化过程中独立出现了几次，但也表明某些家族可能具有发展这一性状的倾向。
为了探究这种复杂的多样性，研究在Noccaea，Psychotria，Geissois，Homalium，Leucocroton等5个属中的采集了7个镍超富集植物的叶片样本，它们分别属于Brassicaceae科、Rubiaceae科和COM进化分支中的Cunoniaceae科、Salicaceae科以及Euphorbiaceae科。经元素分析证实了相应物种的镍超富集状态。研究也收集了没有超富集镍的亲缘关系密切的物种的叶片（表1，图1）。在同一地理区域采集了镍超富集植物和相应的非超富集植物。
表1 De novo的镍（Ni）超富集植物和相关的非镍富集物种的转录本。2 镍超富集植物与相关非富集植物差异表达基因的鉴定
为了鉴定镍超富集植物和密切相关的非富集植物物种之间的差异表达基因（DEGs），基于Illumina pairedend技术，研究对样本进行了RNA测序（RNA-Seq）。在缺乏物种基因组参考序列的情况下，研究使用short paired-end Illumina reads方法，de novo组装了13个选定物种的表达基因序列。这些新产生的转录本包含41843到87243个contigs，总组装大小为35至49Mbp，N50的范围在692至1735 bp之间（表1）。除N. montana外，这些de novo组装的TRANSRATE得分范围在0.31-0.49之间，BUSCO分析表明它们包含61-89%的完整基因和3-9%的缺失基因。这些参数表明，本研究de novo组装的质量在正常范围之内。N. montana的contigs数目明显较多，得分较低，可能是N. montana的异花授粉繁殖增加了其遗传多样性，从而影响了de novo组装。随后使用BLASTX询问Viridiplantae蛋白质数据库对这些转录本进行注释，发现平均56%的contigs具有显著的同源性（E值≤10-6）。这些带注释的参考转录本构成了对感兴趣的植物组进行分子研究的独特而全面的资源。
随后，研究将来自每个环境样本重复的reads比对到镍超富集植物参考转录组，以对8对物种中的DEGs进行鉴定，每对物种中都包含一个超富集植物和一个相关的非富集植物。DEGs的比例从2%到29%不等，这取决于所考虑的物种对（图2a）。进一步研究采用非富集植物的转录组作为参考，计算了每个contig的read计数，并执行了与之前相同的转录组比较，以进行了互换分析，以评估参考转录组选择上的影响。
图2 镍超富集相关基因的跨家族比较转录组学比较及同源类群注释。a代表跨物种比较转录揭示了镍超富集物种（黑色）和相关的非镍富集植物（灰色）之间的差异表达基因（DEGs）；b代表根据其预测功能和其在超富集植物中的表达水平，与镍超富集相关的26个选定的直系基团（COGs）簇的分布；c代表与五个不同科属的镍超富集植物中所选上调的COGs相关的contigs的热图分析；d代表与所选下调的COGs相关的contigs的热图分析。
为了确定失调的分子和代谢途径是否和远亲镍超富集家族存在共享现象，有必要将它们的转录与其突出的功能进行完全比较。为此，研究对基因产物进行了分类。综合13个参考转录本，443400个contigs（占总数的66.5%）被划分为46 458个COGs。在不同植物家族的差异基因表达分析之后，研究使用RCHERRY在COG水平上进行了多次测试分析。研究所选择的上调和下调的COGs在至少三个不同植物家族中的镍超富集植物分别出现了过表达或更低的表达的现象，该分析共揭示了26个不同的组分，其中包括15个上调的COGs和11个下调的COGs（图2b），这些COGs的功能注释表明，上调COGs中最具代表性的类别属于classI transposable elements（TEs）基因（图2c），该基因在反转录以及参与特殊代谢物生物合成和代谢中起作用。除了已知的镍配体的有机酸和氮/氧配体外，最近的研究还强调了苯丙烷类化合物、香豆素和类黄酮作为潜在的金属配体在植物体内金属运输、耐受和富集中的作用。因此，诸如UDP-葡萄糖、花青素、黄酮醇3-O-葡萄糖基转移酶（COG 35）或BAHD酰基转移酶（COG44）等参与特定代谢物生物合成的酶的编码基因的高表达可能因此导致镍超富集植物中金属配体合成的增加。
另一方面，在下调的COGs中最具代表性的类别对应于响应胁迫和细胞壁生物发生或组织的基因（图2d），这后一类包括对应于expansin（COG 75）、木葡聚糖内葡聚糖基转移酶/水解酶（COG 109）和果胶乙酰酯酶（COG 423）的COGs。由于细胞壁结合带正电荷的金属的能力，一方面其可能调节金属的apoplastic迁移率的能力，另一方面又可以作为镍超富集植物中的金属储存库。然而，很难预测这些基因表达的减少对镍超富集植物中金属结合的细胞壁特性的影响。3 叶中IREG/铁转运蛋白的高表达在镍超富集植物中的保守功能基于研究分析发现，在几个植物科中，IREG/铁转运蛋白（COG 1981）有一些强烈上调的功能与镍超富集相关（图2c）。系统发育分析表明，包括N. caerulescens在内的Brassicaceae，都含有两个基因簇，分别以A. thaliana IREG1和IREG2为代表，属于COG1981，这些转运蛋白被证明定位在不同的膜上，因此被认为在金属转运中发挥着不同的功能。在Euphorbiaceae科、Salicaceae科、Cunoniaceae科以及Rubiaceae科的几种植物中，研究也观察到IREG/铁转运蛋白基因的重复。然而，这些转运蛋白没有与AthaIREG1或AthaIREG2聚集在一起，因此不可能推断它们的特定功能。在Brassicaceae科、Rubiaceae科和Euphorbiaceae科的几种镍超富集植物中，编码IREG/铁转运蛋白基因的表达量显著高于其相关的非富集植物（从4倍增加到800倍）。综上所述，这些结果有力地支持了这一假设，即在Asterid clades和Rosid clades中不同的植物科中，IREG/铁转运蛋白在叶片中的高表达在镍超富集植物中起着必要且保守的作用。在所选的源自New Caledonia的Salicaceae科和Cunoniaceae科的物种对中，研究没有检测到IREG/铁转运蛋白的差异表达（图2c）。然而，基于RNA-Seq数据的分析表明，与 Brassicaceae科和Euphorbiaceae科的非镍富集植物相比， IREG/铁转运蛋白基因在Salicaceae科和Cunoniaceae科的超富集植物和非富集植物中都存在高度表达现象。此外，在超富集植物G. pruinosa中检测到的独特的IREG/铁转运蛋白基因（COG1981）的表达量是其同源非富集植物C. capensis中表达量的60倍。IREG/铁转运蛋白基因在特有的非富集物种中的高表达可能是由于之前耐受镍或镍富集植物定植后遗传产生的结果，但经过适应性辐射后，尽管其IREG/铁转运基因高水平表达，但已失去了其所具有的镍富集或耐受的重要功能性状。4 IREG/铁转运蛋白在镍超富集细胞的液泡隔离中具有保守功能为了揭示IREG/铁转运蛋白在镍超富集中的功能保守性，研究从Brassicaceae科、Cunoniaceae和Euphorbiaceae科的3个远亲家族克隆的酵母中表达了IREG/Fe-portin同源基因（图3），这些转运蛋白的表达增加了酵母对镍的抵抗力。结果与IREG/铁转运蛋白作为植物中外排金属的保守功能一致，它将镍排除细胞外，从而降低了胞液的毒性。
图3 表达植物IREG/铁转运蛋白的酵母细胞对镍敏感性。随后，研究以N. caerulescens为模型，研究了IREG/铁转运蛋白在植物镍超富集中的生物学作用。研究选择以拟南芥（A. thaliana IREG2）的直系同源基因NcIREG2为靶标（与非富集植物N. caerulescens 'Viviez’相比较，该基因在镍超富集植物N. caerulescens ssp fimiensis的茎和根中都表现出最强的过表达）（图4）。研究首次利用Rhizobium rhizogenes的根转化技术，在N. caerulescens ssp. firmiensis中表达了C端GFP标记的NcfiIREG2基因。NcfiIREG2-GFP能够补充A. thaliana ireg2突变体的镍敏感表型，表明该融合蛋白所具有的功能。对N. caerulescens进行共聚焦成像显示，NcfiIREG2-GFP定位于液泡的膜上，表明该转运蛋白在这个细胞内隔室的镍储存中发挥了作用（图5a）。为了支持这一假设，研究使用了相同的转化策略，利用人工amiRNA技术来沉默NcfiIREG2的表达。研究产生了8个独立的复合转基因系，显示出不同程度的NcfiIREG2沉默（图5b）。对这些转基因株系的元素分析表明，根中镍浓度的降低与NcfiIREG2的表达有很强的相关性（R2=0.97，P<0.001）（图5c）。相反，这些转基因株系茎叶中镍浓度与NcfiIREG2在根中的表达没有相关性（R2=0.45）。综上所述，这些结果为NcfiIREG2通过驱动镍在液泡中的固存进而促进N. caerulescens ssp. firmiensis根中镍的富集提供了证据。然而，NcIREG2在根中的表达似乎并不是N. caerulescens ssp. firmiensis中镍向地上部运输的限制因子。
图4 镍的富集和NcIREG2在不同Noccaea的同系物中的表达。a代表在Noccaea caerulescens 'Viviez’ （Ncviv），N. caerulescens ssp. firmiensis （Ncfi）以及Noccaea montana （Nmon）的根部和茎叶中镍富集测定；b代表相同植株NcIREG2表达的定量逆转录PCR分析。
图5 IREG/铁转运蛋白NcfiIREG2的定位和沉默。a代表NcfiIREG2定位于Noccaea的液泡膜上；b代表镍超富集植物根部NcfiIREG2的沉默降低了镍的富集；c代表NcfiIREG2表达与镍富集的相关性分析。RNA-Seq技术的发展为分子水平上研究非模式物种提供了可能。然而，鉴于很难定量比较来自遥远物种的转录本的原因，比较生物学并没有从这场革命中充分受益。在本研究中，使用跨物种比较转录分析、COG注释和多重测试分析相结合的方法，在广泛多样的植物科中寻找与镍超富集相关的基因。虽然镍超富集植物和相关的非超富集植物物种之间的两两比较发现了大量的候选DEGs，但预计这些候选DEGs中的很大一部分不仅与镍超富集性状直接相关，还与区分这些物种的其他性状有关。另一方面，对具有独特超富集表型的密切相关物种的配对比较也可能无法揭示这一多基因性状涉及的机制，例如，在New Caledonia的Geissois物种中观察到IREG/铁转运蛋白基因（图2c）。因此，研究的分析集中在不同科属之间的普适性规律上（图2a）。这一策略允许识别在镍超富集中起保守作用的有限数量的候选DEGs。这种策略可能无法识别一组植物（如科、属）特有的分子机制。然而，一种类似的方法可能被用来识别这种特定的机制，但需要增加这一组中的物种数量。有研究发现，IREG/铁转运蛋白的高表达与Brassicaceae和Asteraceae中镍的超富集有关。研究的结果支持这种发现，并进一步表明，IREG/铁转运蛋白已被多次招募，作为镍在多种植物中超富集的普适性规律。有趣的是，研究没有发现其他金属转运蛋白家族，这表明除了IREG/铁转运蛋白外，可能还招募了不同的金属转运蛋白家族来支持超富集植物远距离叶片中镍富集的其他重要步骤。研究的结果还指出，在细胞壁的生物发生和组织以及特殊代谢物的合成中，几种功能具有普适性规律（图2c-d）。涉及苯丙烷类化合物代谢的几个基因的高表达与几个科植物的高富集表型相关。Coumarins和flavonoids具有结合金属的能力，曾被认为与铁营养和镉富集有关。这些结果表明，镍超富集植物合成了与镍的解毒和运输有关的特殊代谢物。然而，所选的COGs的功能注释不允许本研究精确定位特定的路径。对镍超富集植物和相关非富集植物的比较代谢组学分析，可以确定与镍超富集相关的专一性代谢物，从而在已鉴定的COGs和专一性代谢物生物合成途径之间建立直接地联系。最近的一项研究表明，在A. thaliana中过量的镍导致根细胞细胞壁相关基因的表达减少。因此，研究观察到与细胞壁相关的COGs在几个超积累植物中的表达较低。有趣的是，研究的分析还揭示了COG19的上调，对应于镍超富集植物中的细胞壁相关激酶家族（WAKL）（图2c）。WAKL家族成员的表达已被证明是由植物中的金属诱导的，而WAKL4在A. thaliana中表达的增加，增加了其对镍的耐受性。综上所述，这些结果表明，细胞壁结构的改变，至少在特定的组织中，可以在植物的耐镍和超富集中起到保守的作用。研究还鉴定了几个对应于在镍超富集物种中上调的classI retrotransposons 的COGs。众所周知，这些元件的表达对压力条件具有响应，它们的转换可以产生几种表型的突变，这些突变可以导致基因功能失活或增加基因表达。在金属超富集植物A. halleri中，class I retrotransposons与三倍的HMA4基因有关，并可能解释了这种对锌超富集至关重要的金属转运蛋白的高表达。因此，人们很容易推测转座元件通过改变一些重要基因的活性参与了镍超富集性状的进化。虽然金属超富集植物不容易适应基因工程，但仍具有分子遗传学研究的必要，以此证明候选基因在这一复杂特征中的作用。为了支持IREG/铁转运蛋白在镍富集中的重要作用，研究在超富集植物N. caerulescens ssp. firmiensis的根中进行了分子和遗传研究。这些结果表明NcfiIREG2定位于液泡上，根中NcfiIREG2表达的减少强烈影响镍的富集（图5b）。这些结果为NcIREG2在蓝藻细胞液泡镍储存中的作用提供了遗传学证据。令人惊讶的是，NcIREG2在根中的沉默并没有导致叶中镍富集的显著增加（图5c）。这一结果可能看起来是违反直觉的，因为根细胞中金属的固存被认为是限制它们运输的一个因素。研究的研究反而证明，NcIREG2基因在N. caerulescens ssp. firmiensis根系中的表达并不是限制叶片中镍超富集的因子。N. caerulescens ssp. Firmiensis和N. caerulescens'viviez’中NcIREG2的表达和镍富集的平行比较进一步支持了这一结论。这一分析表明，NcIREG2在根中的表达与地上部富集镍的能力之间没有负相关关系（图4）。这一结论不排除NcIREG2在根中的表达可能限制镍在其他Noccaea同系物中向地上部的转运。相反，NcIREG2的高表达和镍在地上部的连续封存可能会产生有利于镍从根向地上部转移的下沉效应。为了直接证明NcIREG2基因在镍超富集中的主要作用，有必要进一步开发N. caerulescens转化方案，对该基因在地上部的表达进行修饰。基于研究在转基因N. caerulescens中获得的广泛的跨种转录分析和功能证据，研究认为IREG/铁转运蛋白在广泛的镍超富集物种的叶细胞液泡中的镍储存中起着保守和必要的作用。这一作用之前曾被提议用于镍超富集菌P. gabriellae的转运蛋白PgIREG1。然而，研究不能完全排除这样一种可能性，即一些在超富集植物中差异表达的IREG/铁转运蛋白同源物可能定位在质膜上，将镍运输出细胞，就像对A.thaliana IREG1转运体的建议。在镍超富集的情况下，这些转运体可能促进镍在细胞间的运输，或者将镍从表皮细胞中运输出来，导致镍在细胞壁中富集。在可持续发展的背景下，镍超富集植物现在被视为从大片含金属土壤中提取和回收金属的作物。至于其他作物，在研究中获得的分子知识可能成为标记辅助选择品种或分子监测农业实践的工具，以改善镍的植物提取。这项工作提供了一个框架，可以从根转录本中识别与镍的有效吸收和向叶片转运有关的其他关键基因。鉴定从根吸收到叶隔离的所有分子步骤对于充分理解这一复杂特性是必要的。
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