编译：冬日暖阳，编辑：十九、江舜尧。
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导读
前列腺是在雄激素的调节下从胚胎泌尿生殖窦发展而来的器官。除了内胚层来源的上皮细胞，前列腺中还有许多其他类型的具有不同胚胎起源的细胞，例如基质细胞，免疫细胞，内皮细胞，神经细胞和脂肪细胞。基质间上皮相互作用已被证明在前列腺的发展和体内平衡以及与前列腺有关的疾病的发生和发展中起着重要作用。
在过去的几十年中，在了解前列腺上皮细胞的谱系层次，特别是在小鼠谱系层次方面取得了很大的进步。相反，研究者对基质谱系的理解比较滞后。基质细胞在人前列腺中丰富，但在小鼠前列腺中相对稀少。众所周知，前列腺基质细胞由具有不同功能和细胞起源的不同亚群组成。在功能上，前列腺基质细胞由平滑肌细胞和成纤维细胞组成。成纤维细胞被称为表达波形蛋白的细胞，通常在腺间间隙中发现。成纤维细胞本身也取决于其激活状态而异质，并在免疫监视和组织修复中起重要作用。人们认为成纤维细胞能够分化为成肌纤维细胞，尽管有这些发现，对前列腺基质细胞的了解却十分有限。缺乏可以确定个体基质细胞亚群的标志物。成纤维细胞特异性蛋白，肌动蛋白α2和波形蛋白是前列腺基质细胞的常用标志物。然而，这些标记物在生理和病理条件下不能区分不同的基质细胞谱系，并且也不对基质细胞具有特异性。因此，使用这些抗原来研究基质细胞的异质性，分离不同的基质细胞谱系并揭示有关基质细胞生物学和功能的新信息在技术上是不可行的。单细胞水平转录组全局分析的最新突破使研究细胞谱系异质性和关系成为可能。在这项研究中，使用成年小鼠前列腺基质细胞的单细胞RNA测序（scRNA-seq）分析。研究表明前列腺基质中存在三种主要的细胞群，大致代表平滑肌细胞和两种类型的成纤维细胞。研究者研究发现了新的表面标记，这些标记可实现不同细胞部分的物理分离，并产生基因表达谱，不仅证实了已知的细胞作用，而且揭示了这些细胞谱系以前未知的功能。
原名：High Resolution Genome Wide ExpressionAnalysis of Single Myofibers Using SMART-Seq
译名：单细胞RNA序列揭示小鼠前列腺基质细胞的功能异质性
期刊：iScience
发表时间：2019.3.29
通讯作者：Li Xin
通讯作者单位：美国德克萨斯州休斯敦贝勒医学院
DOI号：10.1016/j.isci.2019.02.032
1 ScRNA-Seq揭示了成年小鼠前列腺基质细胞中的独特亚群
为了剖析成年小鼠前列腺中的基质细胞异质性，对单个成年小鼠前列腺基质细胞进行了scRNA-seq分析。根据其表面抗原表达谱（Lin−CD24−CD49f−），通过荧光激活细胞分选术（FACS）从8至10周龄的C57BL / 6小鼠中分离出前列腺基质细胞。研究者采用iCell8单细胞系统（Takara Bio）进行单细胞捕获，以实现单个前列腺基质细胞的中间深度表达谱分析。结合Illumina测序，研究者能够分配约7800万个读数，每个细胞最多检测3967个基因。研究分析了严格的质量控制阈值的1,159个单基质细胞的概况，并使用了Seurat 2.0聚类算法来识别数据中强大的细胞簇。使用这些方法，确定了五个主要的细胞群簇（图1A）。为了确定每个亚群的身份和功能，编译了可能与每个亚群特异性相关的前200个基因（图1B），并基于差异基因对每个亚群进行了基因本体论（GO）（图1C）和网络通路分析。图1D显示了每个亚群中具有生物学意义的一些代表性基因。
图1. scRNA-seq揭示了前列腺基质细胞上不同的亚群
2 基于表面表达谱的独特小鼠前列腺基质细胞群的分离
使用在scRNA-seq分析中鉴定的表面抗原将前列腺基质细胞分离为功能不同的亚群。根据scRNA-seq分析，Cd90和Cd200在R1细胞中高表达，而Sca-1和Cd34在R2细胞中高表达。FACS分析显示，所有CD90 +细胞均为CD200 +，而大多数CD34 +细胞均为Sca-1 +。因此，研究者尝试使用CD200和Sca-1进一步分离基质细胞。出乎意料的是，与scRNA-seq分析中显示的CD200和Sca-1的表达呈负相关，这两种抗原在FACS分析中占主要地位。这可能是因为标记之一在很宽的范围内表达。因此，研究者改为将CD90与Sca-1结合使用，以进一步分离前列腺基质细胞。如图2A所示，Sca-1和CD90将Lin−CD24−CD49f−基质细胞分为四个群体。cytospin制剂的免疫染色显示S4种群主要由细胞碎片组成（数据未显示）。为了确定其余三个细胞群的身份，通过FACS分离了单个细胞群，提取了RNA，并对与通过scRNA-seq分析鉴定的三个亚群（R1-R3）相关的基因进行了qRT-PCR分析（图1D）。图2B和2C显示S1和S2部分分别高表达富集在R1和R2群体中的代表性基因。然而，在富集于R3群体的基因中，只有Notch3和Cav1在S3细胞群体中高度表达，而其他基因则主要在S2细胞中表达，这表明R3细胞群体不能有效地从R2细胞中分离出来。因此自然而然地认为R2/S2细胞代表成肌纤维细胞。研究者还研究了三种细胞群中几种主要激素受体的表达水平（图2D）。雌激素受体α（Esr1）和孕激素受体（Pr）在S1和S3细胞中以相对较高的水平表达，而糖皮质激素受体（Gr）在S2细胞中高度表达。雄激素受体在所有三个亚群中以相似的水平表达。根据溴脱氧尿苷掺入的流式细胞仪分析，S1细胞的增殖指数相对高于S2和S3细胞（图2E）。单个基质亚群的分子和表型特征非常稳定。
图2. Sca-1和CD 90分离前列腺基质细胞
3 不同基质细胞群体的解剖定位和激素调控
然后，研究者调查了由Sca-1和CD90分隔的三个不同的基质细胞群体是否在不同的小鼠前列腺小叶之间平均分布。图3A和3B显示，Sca-1+CD90+S1群体在腹侧前列腺中很少，但在前叶中最多。免疫染色证实了Sca-1在所有不同叶的基质细胞中都有表达，但是CD90在腹侧前列腺基质细胞中几乎检测不到（图3C）。由于抗体来源种类的限制，我们无法进行Sca-1和CD90的共免疫染色。相反，我们进行了CD34和CD90的共免疫染色。与scRNA-seq和FACS分析一致（图1D），CD34染色围绕表达角蛋白14的基底细胞，并且与基质细胞中的Sca-1染色显著重叠（中图和下图，图3C）。相反，CD90和CD34主要标记不同的基质细胞群，这也与FACS分析一致。更有趣的是，CD90 +基质细胞与上皮细胞直接接触，而CD34+和Sca-1 +细胞则位于CD90 +细胞层的外侧（上图中中间图的插图中，图中白色箭头所示，图3C）。图3D和3E显示，在去势小鼠中，单个基质亚群的比例的总体模式没有显著改变，只是Sca-1+CD90-/low S2细胞内的CD90-和CD90-/low种群变得更加独特（图3D）。对与R1-R2亚群相关的几个代表性基因的qRT-PCR分析显示，去势小鼠的Sca-1+CD90-/low细胞与Sca-1+CD90-/low总S2细胞和Sca均显示相似的基因表达谱Sca-1+CD90-/low完整小鼠的S2细胞（图3F），表明这些细胞不是响应雄激素致使CD90表达降低的S1细胞。尽管雄激素剥夺并没有改变单个基质细胞群的表型外观，但它下调了S1细胞中的Bmp2和Srd5a2，但上调了Bmp7，并下调了S2细胞中的Ccl2，Ccl11和Ly6c1（图3F）。
图3 不同的前列腺基质细胞的解剖分布和激素调节
3 不同基质细胞谱系对基础细胞分化的不同影响
前列腺基质细胞已被证明可通过并列或旁分泌信号调节上皮细胞的存活和增殖。采用先前建立的前列腺类器官测定法来确定不同基质细胞群是否会影响前列腺基底细胞的类器官形成能力及其分化能力。简而言之，仅在类器官检测法中培养FACS分离的成年小鼠前列腺前列腺基底细胞（Lin−Sca-1+CD49f+），或分别与FACS分离的S1和S2细胞共培养。为了测试S1和S2细胞之间的串扰对于调节基础上皮干细胞的活性是否必要，包括第四组，其中基础细胞与S1和S2细胞都共同培养。图4A显示，与仅具有基底细胞的对照组相比，在所有三个共培养组中基底细胞的类器官形成活性增加了1.27至1.38倍。此外，类器官的大小也显著增加了1.08倍至1.15倍（图4B）。因此，增加的类器官大小可能反映了类器官细胞增殖的增加。对照组中形成的大部分类器官（96.7％）由表达基底细胞标记细胞角蛋白5（K5）和腔细胞标记细胞角蛋白8（K8）（以下称为I型类器官）的细胞组成，图4C。相反，剩余的3.3％的类器官由高表达K5但弱表达K8的细胞组成（以下称为II型类器官，图4C）。这两类类器官可能反映了类器官细胞的分化状态或它们各自细胞起源的不同特征。有趣的是，基础细胞与不同类型的基质细胞的共培养显著增加了II型类器官的百分率（S1和S2共培养分别为19.5％和74.1％）（图4D）。S1和S2细胞共培养组中II型类器官的百分比（23.8％）介于S1共培养和S2共培养组之间，这表明在这两个间质细胞群之间没有协同作用或干扰。为了确定这种活性是通过直接的细胞-细胞接触还是旁分泌信号传导来介导，将FACS分选的前列腺基底细胞和基质细胞分别悬浮在Matrigel中，以便它们在类器官测定中共培养，但不直接接触。总之，这些结果表明，在类器官分析中，S1和S2细胞抑制基底细胞双能分化的独特能力取决于它们的不同分泌组。为了确定基础细胞与基质细胞的共培养是否会影响其自我更新的能力，在图4D所示的每个类器官培养物中对FACS排序的基础细胞进行了分选，并将它们单独传代。图4E显示在次要培养中类器官形成活性均降低，但在共培养组中降低更为明显（仅基底细胞组从19.9％降至4.8％，而在共培养组中则从25.8％降低至2.3％组）。S2和S1 + S2组中类器官的大小比对照组稍大（1.15至1.17倍）（图4F）。出人意料的是，在所有文化中，II型类器官都成为类器官的主要类型（图4G）。这意味着在类器官培养期间，FACS分选的基础细胞发生了变化。
图4. S2细胞抑制前列腺基底细胞的双能分化
使用scRNA-seq将前列腺基质细胞分为具有不同生物学功能的三个主要种群（R1-R3）。根据从scRNA-seq获得的信息，研究者能够鉴定出区分三个群体中的两个群体的表面抗原：Sca-1+CD90+ (S1)和Sca-1+CD90-/low(S2)基质细胞大致对应分别连接到R1和R2单元。两种细胞群均基于其代表性纤维母细胞相关基因的表达而显示出成纤维细胞表型，但与R2细胞相比，R1细胞表达的成纤维细胞标志物波形蛋白相对较低。R2细胞高表达S100a4和Acta2以及许多炎症相关基因，提示成肌纤维细胞表型。R1细胞表达各种生长因子，包括Bmps和Wnts，以及DHT合成所必需的酶Srd5a2。这些特征表明，CD90+细胞在前列腺上皮细胞的生长和雄激素介导的存活中起重要作用。有趣的是，去势后S1细胞中的Srd5a2（一种对DHT合成至关重要的酶）被下调。这些观察表明，CD90+基质细胞可能在前列腺上皮细胞的雄激素调节存活中起关键作用。CD90+细胞在腹侧前列腺小叶中很少见。
R3细胞由表型平滑肌细胞组成。这些细胞还高度表达了参与组织发育和体内稳态，神经发生和血管生成的基因，这表明平滑肌细胞除了具有简单的支持和收缩作用外还具有其他重要功能。然而，无法鉴定能够特异性分离R3细胞的表面标记物的组合。平滑肌细胞可能在单细胞制备过程中更容易受到机械和酶消化的影响，从而在测定过程中被部分消耗（图2A）。此外，CD90和Sca-1不足以将R3细胞与其他细胞群区分开，因为qRT-PCR分析表明，在S2和S3中均可检测到R3细胞中高表达的基因（图1C）。有趣的是，研究表明，即使在延长的体外培养后S1和S2细胞的表型特征（例如表面抗原和特定基因的表达）也是相对稳定的。该观察表明，它们可能具有不同的发育起源，这些发育起源决定了它们的分子表型和功能特性，这也与先前的研究一致。
前列腺类器官测定法为前列腺基底细胞生存、增殖和分化为具有管腔表型的细胞提供了一种可借鉴的方法。本研究数据显示与S1，特别是S2细胞共培养基础细胞会阻止基础细胞的腔内分化。此外，以前已经证明前列腺炎症可以诱导基底到管腔的分化，这也伴随着细胞增殖的增加。令人惊奇的是，产生细胞因子的Sca-1+CD90-/low细胞可以刺激类器官生长，但抑制分化。这表明体内和类器官试验中的炎症和刺激生长的信号传导并不完全相同。然而，在类器官分析中去除R-spondin或添加Wnt抑制剂IWP-2只会减少类器官的数量和大小，而不会减少细胞的分化状态。此外，S2细胞并不总是比S1细胞表达更多的Wnt抑制剂（图S4M）。因此，在类器官分析中，S2细胞不太可能通过干扰基底细胞中的Wnt信号传导来阻断基底至腔的分化。未来的基因表达和蛋白质组学分析可能会提供有关潜在机制的更多见解。
使用单细胞RNA测序分析，以调查成年小鼠前列腺基质细胞的表型和功能异质性。本研究分析确定了代表平滑肌细胞的三种主要细胞群以及富含Sca-1和CD90的两种类型的成纤维细胞。Sca-1+CD90+成纤维细胞与上皮细胞直接接触，并表达与细胞运动，发育过程和雄激素生物合成相关的生长因子和基因。这表明它们可能调节上皮细胞的存活和生长。Sca-1+CD90-/low成肌纤维细胞样细胞高度表达与细胞外基质和细胞因子介导的信号通路相关的基因，表明在组织修复和免疫应答中起作用。Sca-1+CD90-/low细胞在前列腺类器官测定中显著抑制了基底细胞的双能分化能力。研究者确定表面标记，使基质亚群能够物理分离，并产生暗示其细胞功能的基因表达谱。研究的局限性，在这项研究中，将小鼠前列腺基质细胞分为三个不同的种群。这些种群也是异质的，应该能够通过其他研究进一步亚分类，包括更多具有更深阅读深度的细胞。
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