科研│ CELL STEM CELL（IF：20.86）:在单细胞分辨率下探究肠道生态微环境发育图谱
编译：微科盟 Champion，编辑：微科盟景行、江舜尧。
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人类肠道干细胞的生态位支持自我更新和上皮功能，但对其发育情况知之甚少。本研究使用单细胞mRNA测序和原位验证的方法来探究受孕后7-21周的人类肠道发育，为细胞和构成生态位的因素分配分子身份和空间位置。靠近增生隐窝的粘膜肌层平滑肌细胞是WNT和RSPONDIN配体的来源，而EGF在远离隐窝的绒毛上皮中表达。相反，PDGFRAHI/F3HI/DLL1HI间充质细胞群体排列在隐窝-绒毛轴上，是表皮生长因子（EGF）家族成员NeuRegin1（NRG1）的来源。在发展肠道肠样培养中，NRG1，而不是EGF，允许通过分泌谱系的分化来增加细胞多样性。这项工作突出了肠道EGF/ERBB信号的复杂性，并描绘了发育中的肠道的关键生态位细胞和信号。
论文ID
原名：Mapping Development of the Human Intestinal Niche at Single-Cell Resolution
译名：在单细胞分辨率下探究肠道生态微环境发育图谱
期刊：Cell Stem Cell
IF：20.86
发表时间：2020年12月
通讯作者：Jason R. Spence
通讯作者单位：美国密歇根大学
DOI号：10.1016/j.stem.2020.11.008
实验设计
结果
1 单细胞分辨率下探究发育中的人小肠
鉴于人们对胎儿肠道间充质细胞的异质性知之甚少，本研究的目标是更好地了解构成发育中的人类ISC生态位的间充质细胞群体。为此，从刚开始绒毛形态发生（受孕后47天）的人胎儿十二指肠或十二指肠及其邻近的近端小肠（在非常年轻的组织的情况下）获得了样本，并进行了组织学和分子分析（图1A和1B）。主要的生理变化发生在整个发育窗口中：长度和周长快速增长，上皮内形成绒毛和隐窝区域，间充质内平滑肌层的组织和分化增加（图1A）。为了捕获有助于人体肠道发育的全部细胞类型，从受孕后47天到132天的8个样本中分离出全层肠道组织，并使用scRNA-seq对每个样本在过滤和去除环境RNA后的2,830-3,197个细胞进行测序（STAR方法）。通过计算质量过滤后，总共使用24,783个细胞进行分析（图1B）。进行降维和可视化分析之后，使用规范基因通过识别主要细胞类别，包括上皮细胞、间充质细胞、内皮细胞、肠神经细胞和免疫细胞，分别对每个样本进行注释（图1C）。通过计算提取了间充质并对其进行了重新聚集（每个样本1,462-2,054个细胞），并注释了一组PDGFRAHI细胞，以及ACTA2+/TAGLN+平滑肌细胞（图1E）。
根据细胞的发育年龄（受孕后几天）对细胞进行了大致排序（图1D）。第47天的细胞基本上与其他时间点分离，除了血管平滑肌细胞（VSMCs）的ACTA2HI/TAGLNHI/RGS5+群体（图1D和1E）。然后根据发育时间对细胞进行排序，将101天（101天、122天、127天和132天）以上的样本中的细胞聚集在一起。除了VSMC群体外，这一分析还表明出现了几个间充质群体，包括PDGFRAHI/F3HI/DLL1HI群体，GPX3HI群体，TAGLNHI/RGS5-平滑肌群体，以及根据胶原基因（COL1A1和COL1A2）和核心蛋白聚糖（DCN）的表达而定义为成纤维细胞的显著细胞群（图1E和图1D）。最近发现F3在与人结肠上皮相邻的一群间充质细胞中表达，这些细胞还具有富集NPY、DLL1、FRZB、和SOX6的特征（图1E）。
2 跨发育时期间充质细胞谱系的出现
强制导向布局表明，间充质细胞群体在不同发育期间出现。例如，F3HI/PDGFRAHI细胞在大约59天后出现，而GPX3HI/F3LO/PDGFRALO和TAGLNHI/RGS5-平滑肌细胞在大约80天后出现。为了证实scRNA-seq分析，使用了一种组合染色方法，利用多重FISH和IF检测了F3mRNA和TAGLN基因的蛋白产物SM22（图1F），发现F3在59天时不表达，但在78天时在绒毛间充质中有明显的表达，随着时间的推移，F3的表达变得更加局限于SECs。有趣的是，观察到F3在59天时在scRNA-seq中表达；然而，由于胎儿组织分期是一个近似值，样本可能比它们的实际标记略老或更年轻，从而解释了这样的微小差异。SM22在第59天的肠道中有表达，但仅在最外层的外肌层有表达。SM22在粘膜肌层（最接近肠上皮和邻近增殖隐窝区域的一层）中的表达，在100d时首次被观察到为靠近上皮的组织不良的细胞，在这一时间点之后变得更有组织。单细胞分析和FISH/IF共同提示间充质细胞的出现与增殖性绒毛间质/隐窝结构域的形成相一致。为了了解100天后间充质细胞群体在组织内的空间组织方式，使用FISH/IF并证实F3HI细胞共表达PDGFRA、DLL1和NPY（图1G）。有趣的是，NPY标记了F3HISEC的一个子集，排列在绒毛内，但在绒毛SECs中缺失（图1G）。GPX3HI/F3LO/PDGFRALO细胞在肠绒毛中心最为丰富，与NPYHI细胞相邻（图1E）。
图1.人十二指肠发育过程中间充质的异质性。（A）人胎儿小肠切片上恒定尺度的H&E染色，时间跨度为54-130天。（B）由scRNA-seq分析的样本和相应细胞数的时间线。（C）通过scRNA-seq分析的每个样本的UMAP可视化，按年龄后受孕显示。（D）力导向布局说明了所有时间点的间充质细胞和时间点之间的关系。细胞根据样本身份（受孕后的天数）进行着色。（E）不同谱系（包括PDGFRA、F3、DLL1、NPY、GPX3、TAGLN、ANO1和RGS5）的单个基因的特征图，绘制在（D）所示的力导向布局上。（F）F3（粉红色）FISH染色和SM22（TAGLN蛋白产物；绿色）与DAPI（灰色）免疫荧光蛋白染色的典型图像。（G）利用FISH技术对发育中的人体肠道中PDGFRAHI/DLL1HI/F3HI和GPX3HI间充质细胞的空间特征进行研究。
3 在发育中的肠道中识别可能的人类ISC生态位因子
目前还没有使用scRNA-seq等高分辨率技术在发育中的人类肠道中研究生态位因子。为了确定可能的生态位因子，首先确定了人胎儿肠道中哪些细胞表达已知的生态位因子。研究人员观察到，F3HI/PDGFRAHISECs和GPX3HI/F3LO/PDGFRALOvilus核心细胞缺乏大多数已知的生态位因子的表达（图2A和2B），而WNT通路成员是RSPO2、RSPO3和WNT2B，它们在TAGLNHI/RGS5-平滑肌细胞和COL1A1HI成纤维细胞中表达，但在F3HI/PDGFRAHI SECs中不表达（图2A）。EGF是小鼠肠样培养中增殖的关键驱动因素,然而，EGF在间质中没有观察到表达，而EGF家族成员NRG1在F3HI/PDGFRAHI细胞群中表达丰富（图2A和2B）。值得注意的是，NRG1是F3HI/PDGFRAHI细胞群体中表达最强的EGF家族成员之一。如果将SM22与FISH结合使用，则RSPO2、RSPO3、WNT2B、EGF和NRG1的表达模式与scRNAseq数据一致（图2C）。鉴于EGF在体外肠样培养中的重要性，通过scRNA-seq和FISH进一步研究了EGF和EGF受体是否在发育中的肠上皮细胞中表达。所有的上皮细胞都被提取并重新聚集，在应用Harmony之后，使用力定向布局将数据可视化（图2D）。ERBB受体，包括EGFR、ERBB2和ERBB3，广泛表达于整个上皮，FISH证实了这一发现，而ERBB4不表达（图2E和图2F）。虽然EGF在肠间充质中不表达（图2A-2C），但观察到EGF在一小部分分化的上皮FABP2HI肠细胞中表达（图2G），这一发现得到了FISH和IF的支持，并表明EGF在增殖性隐窝区域低表达/不表达，但在MKI67+隐窝区域以上和整个绒毛上皮中表达 （图2D）。另一方面，NRG1在靠近隐窝的F3HI/PDGFRAHISECs中表达（图2C、2H）。
图2. 识别发育中的人类小肠中的干细胞生态位因子。（A）在力定向布局上注释了几个间充质亚群的近似表达域的概要示意图。（B）各时间点间充质细胞中几个独立ISC生态位因子的特征图。（C）在发育中的人类胎儿隐窝中，对生态位因子EGF（绿色）、NRG1（绿色）、WNT2B（粉色）、RSPO2（粉色）和RSPO3（粉色）进行多重FISH，结合SM22（蓝色）、DAPI（灰色）的免疫荧光蛋白染色和F3（绿色）的FISH。（D）力导向布局说明了所有时间点的上皮细胞和时间点之间的关系。细胞根据样本身份（受孕后的天数）进行着色。（E）将EGFR、ERBB2、ERBB3和ERBB4的特征曲线图绘制在（D）所示的力导向布局上。（F）人胎儿隐窝发育过程中EGFR（粉红色）、ERBB2（绿色）和ERBB3（红色）的FISH染色，以及ECAD（蓝色）和DAPI（灰色）的免疫荧光染色。（G）EGF和肠细胞标记FABP2的特征图绘制在（D）所示的力导向布局上。（H）EGF（粉色）和NRG1（绿色）多重FISH的代表性图像，偶联MKI67（蓝色）和DAPI灰色）的免疫荧光蛋白染色。
4 NRG1不支持已建立的肠样培养物的增殖和生长
根据NRG1的表达模式，研究者认为NRG1可能作为ERBB生态位信号转导信号，并可能在体外与ISCs在体内发育的肠道内的定位和接近而具有生理相关性。为了探讨NRG1和EGF对肠上皮细胞的影响，使用标准生长条件（WNT3a/RSPO3/NOG+EGF）将已建立的人胎儿十二指肠上皮源性肠样（取自142d的标本）分成两组。其中一组在标准培养基中加入EGF（100ng/mL），另一组不加EGF而添加NRG1（100 ng/mL）（图3A）。在EGF或NRG1中生长5天后，肠突没有表现出明显的不同（图3B）。在使用IF和FISH进行验证时，观察到EGF生长的培养物有OLFM4+和OLFM4-，MKI67染色显示，本组肠样体高度增生（图3C）。经NRG1处理的肠突似乎有更均匀的OLFM4表达，但每视野Ki67+细胞也较少。为了更加进一步探索这些差异，每组都进行scRNA-seq分析。尽管在培养中只改变了EGF或NRG1，但观察到两组之间的基因表达差异，如UMAP图所示，根据培养基成分几乎完全独立地聚集细胞（图3D和3E）。例外的是第4簇，它表达增殖标记（MKI67和TOP2A），并对两个样本都有贡献（图3E和3F）。第4组似乎有更多的来自EGF生长的肠样体的细胞，按比例，来自EGF处理的肠样体的细胞4%（2,789个细胞中的115个）在这个簇中，而来自NRG1处理的肠状突中的细胞不到0.5%（2,720个细胞中的10个）在这个簇中（图3G）。这些数据表明NRG1抑制了增殖。两组的肠样都广泛表达OLFM4，尽管在NRG1中生长时的表达水平似乎略高，这表明这些样本通常几乎没有异质性，主要由未分化的干细胞组成（图3H）。注意到，NRG1簇中的细胞子集表达肠细胞标记FAPB1，以及子集细胞表达分泌性祖细胞标记SPDEF（图3H）。这些数据表明，NRG1培养的一些细胞可能处于分化的早期阶段；然而，表达模式的差异还不足以形成不同的簇。为了从功能上评估NRG1处理的肠样细胞增殖减少的观察结果，进行了大量传代，然后允许它们在标准生长条件下（EGF，100ng/mL）扩张3天。然后去除表皮生长因子24小时，将肠样组织分离成单细胞悬浮液，每滴Matrigel培养5000个细胞。单细胞接种后，立即加入不含EGF的标准培养液（对照组），仅添加EGF（100 ng/mL），仅添加NRG1（100 ng/mL），或添加NRG1（100 ng/mL）和EGF（100 ng/mL）（图3I）。正如预期的那样，在标准的表皮生长因子条件下，观察到10天后肠突的重建。相反，在对照组和仅添加NRG1的培养物中观察到几乎没有肠样恢复，而这种生长缺陷在NRG1+EGF条件下被挽救（图3I）。这些功能结果进一步表明，在已建立的肠样培养中，EGF相对NRG1可促进增殖。
图3.NRG1不支持已建立的肠样细胞的增殖和生长。（A）实验示意图。（B）在EGF（100ng/mL）或NRG1（100ng/mL）存在下生长5天后的代表性立体显微镜图像。（C）在生长EGF（100ng/mL）或NRG1（100ng/mL）的肠样组织中进行OLFM4（粉红色）的FISH染色或MKI67（粉色）的免疫荧光蛋白染色，再加上ECAD（蓝色）和DAPI（灰色）的代表性图像。（D）UMAP包埋肠样scRNA-seq数据（共5,509个细胞），显示5个指定的簇（n=1个生物样本测序，142天胎儿样本）。（E）UMAP包埋培养条件染色的肠样scRNA-seq数据（表皮生长因子，2,789个细胞；NRG1，2,720个细胞）。（F）MKI67的特征图，说明大多数增殖细胞位于第4群。（G）条形图，描绘处理组第4群的细胞百分比。（H）显示干细胞标记OLFM4、分泌前体标记SPDEF和肠道细胞标记FABP1表达的特征图。（I）肠样体形成实验示意图（左），在没有EGF家族配体的情况下，或在EGF（100 ng/mL）、NRG1（100 ng/mL）或EGF和NRG1（各100 ng/mL）存在的情况下，单细胞传代和10天生长后的肠样形成实验示意图和立体图像。
5 NRG1的长期肠样生长与体外上皮多样性增加相关
先前的实验是用在含有EGF的长期培养中建立和扩大的肠样细胞进行的，实验数据（图3）表明这些培养物高度依赖EGF进行增殖。为了确定不同的EGF家族成员对肠样体的建立和长期生长的影响，研究人员在标准生长条件（WNT3a/RSPO3/NOG；STAR法）下培养新鲜分离的肠腺，不加EGF/NRG1（对照组），添加EGF（100 ng/mL），NRG1（100 ng/mL），或EGF和NRG1（各100 ng/mL）的组合（图4A）。使用这些培养物进行长期传代、成像、肠样形成定量分析和scRNA-seq（图4A）。肠腔在所有条件下均成功建立（图4B）。除对照组（无EGF/NRG1）未能扩增出初始平板外，所有条件均成功连续传代。为了确定不同生长条件对肠样形成能力的影响，对P2存活的培养物进行了定量的单细胞传代实验。为此，将三个处理组分离成单个细胞，每滴Matrigel培养1,000个单细胞，让培养物生长11天，并量化恢复的肠样细胞数量。用FISH检测传代后剩下的所有三个组（EGF、NRG1和EGF/NRG1），或者发现OLFM4在所有条件下都有表达，MKI67在每个视野下没有不同的表现（图4C）。仅NRG1组在肠腔内的MUC2染色较多，而包括EGF（仅EGF和NRG1/EGF）的两组在上皮细胞中均有广泛的LYZ表达（图4C）。考虑到在比较治疗组时观察到的MUC2和LYZ的IF染色模式不同（图4E），使用scRNA-seq检测了这些肠样的细胞组成和分子特征。测序了生长在EGF（100 ng/mL）中的3262个细胞，生长在NRG1（100 ng/mL）中的7350个细胞，以及生长在NRG1和EGF（100ng/mL）中的2593个细胞。UMAP降维显示，NRG1处理的肠状突与仅EGF处理的肠状突有明显的聚类，并表明NRG1/EGF肠状突与仅EGF处理的肠状突具有高度的分子相似性，因为这些样本在聚类中重叠（图4E和4F）。检查每个样本的集群分布，很明显，EGF和EGF/NRG1肠样细胞对相同的集群（集群1、2、7和8）有贡献，而NRG1对许多不同的集群（0、3、4、11和12）有贡献（图4F）。几个簇表达干细胞标记OLFM4（EGF和EGF/NRG1：簇1、2和8；NRG1：簇0、3和4）。第6簇在所有3组中均有贡献，并表达肠细胞基因。在NRG1生长的肠样细胞中，第11簇表达与分泌和杯状细胞（MUC2）相关的基因，第12簇表达与肠内分泌细胞（CHGA）相关的基因（图4I）。根据IF染色结果，检测了LYZ的表达。如IF所示，LYZ在EGF和NRG1/EGF肠样体中的表达水平较高；然而，NRG1治疗组中也广泛观察到低水平的表达（图4I）。这些数据表明，EGF和NRG1可以促进新建立的肠样体的长期存活，但它们对基因表达和细胞多样性的影响不同。
6 定位到肠道参照物揭示了肠道中细胞的异质性
为了进一步询问生长在EGF、NRG1和EGF/NRG1中的肠样细胞的细胞异质性，使用人胎儿上皮作为高维搜索空间来确定肠样细胞与其体内对应物之间的潜在对应关系。用这四个超过100天（101-132天）的样本确定了人类胎儿肠道的主要上皮细胞群。这些样本是根据和声增强后的力导向布局选择的，这表明在这些时间段内发育/分化没有发生重大变化。根据已发表的数据，定义了9种上皮细胞类型，包括ISCs（簇2：LGr5和OLFM4）、肠细胞（簇0和簇3：FABP2、Alpi和RBP2）、BEST4+肠细胞（簇5：BEST4和SPIB），杯状细胞和杯状细胞前体（簇5：BEST4和SPIB）。肠内分泌细胞（EECS；簇1和8：CHGA、NEUROD1、PAX6、ARX和REG4（图4K和4L）。然后，使用摄取将生长在EGF、EGF/NRG1或NRG1中的肠样体映射到活体上皮上（图4M），确定映射到每种活体细胞类型的细胞的比例，并将其与初级肠道中看到的细胞分布进行比较（图4N）。EGF和EGF/NRG1样本具有相似的分布模式，两种情况下的大多数细胞都映射到ISCs和肠上皮细胞（图4M和4N）。NRG1处理的肠样体被映射到所有类型的细胞，包括杯状细胞（第4簇）、CHGA+EECS（第8簇）、簇状细胞（第7簇）和BEST4+肠细胞（第5簇），这些细胞在本分析中没有出现在EGF或EGF/NRG1培养的肠突中（图4M和4N），这些细胞类型包括杯状细胞（第4簇）、CHGA+EECS（第8簇）、簇状细胞（第7簇）和BEST4+肠细胞（第5簇）。这些结果进一步支持了NRG1培养的肠样细胞相对于生长在EGF中的肠样细胞具有促进细胞分化的作用。
图4.在NRG1中建立新的肠样细胞系可增加体外细胞类型的多样性。（A）实验示意图。（B）每种情况下的肠样体的典型立体图像。（C）在EGF、NRG1或EGF和NRG1存在下生长11天后，肠道中OLFM4（粉色）或MKI67（粉色）、MUC2（粉色）、LYZ（粉色）、ECAD（蓝色）和DAPI（灰色）的典型FISH图像。（D-J）scRNA-seq在EGF、NRG1和EGF/NRG1双重条件下于P1、11d体外生长后（n=1个生物样品测序，105d胎儿样品）进行检测。（D）UMAP包埋13,205个肠样细胞，按群集特征着色。（E）UMAP包埋肠样细胞（EGF，3262个细胞；NRG1,7350个细胞；EGF/NRG1,2593个细胞）。（F）描绘每种情况下细胞类型丰度（占排序细胞总数的百分比）的条形图。（H）条形图描绘了在每种情况下映射到增殖簇（第4或第8簇）的测序细胞的比例。（I）肠上皮谱系的特征图。（J）条形图，描绘在第6组（肠上皮细胞）、第12组（EECS）和第11组（杯状细胞）中存在的每种情况下的细胞测序比例。（K）从原代小肠标本（n=4；101、122、127和132天）提取上皮细胞（828个细胞），通过计算、重新聚集和UMAP显示。（L）根据典型谱系标记的表达来指定群集身份。（M）使用Ingest函数将存在EGF(100 ng/mL)、NRG1(100 ng/mL)或EGF和NRG1(100 ng/mL)的肠样映射到(K)中给出的原代肠上皮样品上。（N）测定各处理组的原代肠上皮和肠样细胞在活体肠上皮中识别的9个簇的细胞丰度。
结论
该研究利用scRNA-seq来表征发育中的人类肠道干细胞微环境的细胞多样性。转录和空间分析表明，NRG1由PGDFRAHI/F3HI/DLL1HI上皮间充质细胞表达，NRG1在肠样培养中能增加细胞多样性。此外，该研究基于scRNA-seq和FISH，研究人员观察到WNT2B、RSPO2和RSPO3在人类胎儿肠道的粘膜肌层以及成纤维细胞中表达。与最近的成人结肠的单细胞研究和小鼠研究相比，这是一个独特的发现。
1 综述 | 美国范德堡大学：利用单细胞组学技术对胃肠道疾病进行研究：从单细胞特征到病人特征
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