科研 | Plant Molecular Biology :甜菜对碱胁迫应答的转录组分析(国人佳作)
编译:云佩b,编辑:十九、江舜尧。
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碱性是一种高度胁迫的环境因子,会限制植物生长繁殖。甜菜能在各种非生物胁迫下驯化,尤其是碱胁迫的情况。虽然前人已经对甜菜的碱胁迫应答做过许多研究,但其碱胁迫应答基因的表达情况未见报道。本研究中,研究者对盐碱溶液处理0天(对照,C)、3天(短期碱处理,ST)、7天(长期碱处理,LT)的甜菜苗叶片进行了转录组研究。纯净读段组装成25507个unigene。其中,ST vs C和LT vs C组中分别鉴定出975、383个差异表达基因(DEG)。基因本体(GO)分析显示,氧化还原过程和脂质代谢过程分别是T vs C和LT vs C组DEG中富集程度最高的GO term。根据KEGG通路分析,碱胁迫下,光合器官通路中的碳固定有显著富集。此外,编码d-3-磷酸甘油酸乳酸脱氢酶1、谷氨酰-tRNA还原酶1、脂肪酸脂氢过氧化物裂解酶、乙烯不敏感蛋白2、金属耐受蛋白11和镁离子螯合酶亚基Ch1I等的基因表达水平在碱胁迫下显著改变。在DEG中,136个为无注释基因,24个有差异可变剪切。本研究为碱应答基因提供了有价值的资料,有助于碱胁迫耐受型甜菜的改良。
论文ID
原名:Transcriptome analysis of sugar beet (Beta vulgaris L.) in response to alkaline stress
译名:甜菜对碱胁迫应答的转录组分析
期刊:Plant Molecular Biology
IF:4.06
发表时间:2020.01
通讯作者:李彩凤
通讯作者单位:东北农业大学农学院
DOI号:10.1007/s11103-020-00971-7
实验设计
结果
碱处理对甜菜生理、生长特性产生影响
为测试不同时长碱处理对甜菜生理特性的影响,研究者测量了经碱处理0天、3天、7天的甜菜中脯氨酸浓度、POD活性和MDA含量。如图1a-c所示,不同时长碱处理对以上三项生理特性有显著影响。这些生理差异表明,经过碱处理甜菜的基因表达情况可能发生了显著变化。
为测试长期碱处理对甜菜的影响,研究人员测量了水培甜菜碱处理7天后的生长和光合特性。碱处理组可见形态变化(图2a)。碱处理显著抑制植株生长。碱处理后,植株的光合特性显著改变(图2b-d)。例如,碱处理植株中,光合速率(Pn)、气孔导度(Gs)、蒸腾速率(Tr)显著低于对照组植株(图2b-d)。然而,碱处理组与对照组之间的光合量子产额未见显著差异。光合和生长特性的显著改变说明碱性对植物生长具有抑制作用。
图1 碱处理对生理特性的影响。a-c 分别为脯氨酸浓度的变化、过氧化物酶(POD)活力的变化、丙二醛(MDA)含量的变化,样品叶片经过0、3、7天处理后采摘。C为对照组,ST为碱处理3天组,LT为碱处理7天组。误差线代表三个生物学重复之间的SD。星号代表碱处理组与对照组之间的显著性差异(*P < 0.05; **P < 0.01)。
图2 碱处理对生长特性的影响。a 有/无75μM碱处理水培7天的植株的形态。b-e 碱处理7天后的净光合速率(Pn)、气孔导度(Gs)、蒸腾速率(Tr)和光合量子产额(Y(II))。C为对照组,ST为碱处理3天组,LT为碱处理7天组。误差线代表三个生物学重复之间的SD。星号代表碱处理组与对照组之间的显著性差异(*P < 0.05; **P < 0.01)。
RNA测序数据的序列分析及装配
移除低质量接头和条形码序列后,从正常组(对照,C)、碱处理3天组(短期处理,ST)、碱处理7天组(长期处理,LT)文库中分别获得了9.282、8.851和9.139千万个原始读段。获得了超过97.85%的高质量读段(滤后读段),可用于下游分析(表1)。比对结果显示,67.71%-70.03%的滤后读段可比对到参照基因组中。在HISAT2工具中,约5.861 (64.52%)、5.474 (63.18%)和5.863 (65.56%) 千万个分别来自C、ST、LT组文库的读段可以唯一地匹配到参照基因组上。从所有样品的装配读段鉴定出25507个基因,可用于碱胁迫下甜菜转录的后续分析。
表1 转录组测序结果统计
差异表达基因(DEG)的鉴定
对不同状态下(C、ST和LT)的甜菜进行转录组比较,构建2组配对:ST_vs_C和LT_vs_C。ST_vs_C和LT_vs_C组分别有975、383个显著DEG(图3a)。其中,在ST_vs_C和LT_vs_C中均可鉴定的DEG有88个。结果表明,在对照组和碱处理组之间,基因表达水平具有显著差异。ST_vs_C组有573个上调表达基因和403个下调表达基因,LT_vs_C组有261个上调表达基因和122个下调表达基因(图3b、c)。其中,在两组中均有上调的DEG有52个,均下调的DEG有30个。明显,在碱胁迫下,ST_vs_C和LT_vs_C组的上调表达DEG更多。而且,在碱胁迫下, ST_vs_C组组响应碱性的DEG多于LT_vs_C组(图3)。
DEG的GO和KEGG通路分析
进行GO term和KEGG通路功能富集分析,以确定可能参与了碱响应的生物过程或通路。在ST_vs_C组中,“氧化还原酶活性”(GO:0016491,56个上调表达基因、40个下调表达基因)、“结构分子活性”(GO:0005198,12个上调表达基因、38 个下调表达基因)和“核糖体结构组成”(GO:0003735,4个上调表达基因、31个下调表达基因)是分子功能(MF)本体下富集程度最高的3个GO term;“单器官代谢过程”(GO:0044710,87个上调表达基因、70 个下调表达基因)、“氧化还原过程”(GO:0055114,49个上调表达基因、48 个下调表达基因)和“小分子代谢过程”(GO:0,044,281,33个上调表达基因、27个下调表达基因)是生物过程(BP)本体下富集程度最高的3个GO term,表明参与这些过程的基因在碱响应方面有重要作用(图4a)。在LT_vs_C组的DEG 中,MF分类下的“辅酶结合”(GO:0050662,10个上调表达基因、5 个下调表达基因)、BP分类下的“脂质代谢过程” (GO:0006629,10个上调表达基因、14 个下调表达基因)和“细胞脂质代谢过程”(GO:0044255,6个上调表达基因、9 个下调表达基因)是富集程度最高的GO term(图4b)。GO分析可以为DEG功能提供更清晰的理解。
图3 甜菜两个比较组的DEG的韦恩图。a 全部DEG 的分布;b 上调DEG;c 下调DEG。
图4 两个比较组中DEG富集程度最高的GO term。a ST_vs_C;b LT_vs_C。 MF=分子功能;BP=生物过程;CC=细胞组成。
为进一步研究参与、富集到各代谢通路中的DEG,使用KEGG通路数据库进行分析。ST_vs_C组中有630个DEG可归到90个功能子项下,LT_vs_C组中有223个DEG可归到68个功能子项下。我们进一步鉴定了过度表达的KEGG本体(KO)term(p<0.05)并将这些term分为12类(表2)。在ST_vs_C组中,在“核糖体”通路中有最多的DEG(48个下调表达基因),随后是“光合器官中的碳固定”(5个上调表达基因、5 个下调表达基因)(表2)。在LT_vs_C组中,“胞吞作用”(6个上调表达基因)、“乙醛酸和二羧酸代谢”(1个上调表达基因、4 个下调表达基因)和“光合器官中的碳固定”(2个上调表达基因、3 个下调表达基因)是富集程度最高的KEGG通路(表2)。这些结果表明,此生代谢可能对碱响应基因表达调控具有调节作用。这些注释将为研究甜菜中碱胁迫应答的相关通路提供有价值的参考。
表2 两个比较组中DEG的KEGG富集分析
差异可变剪接分析
可变剪接(AS)是真核生物基因调控的重要机制。研究确认了5类主要的AS事件:内含子保留(RI)、外显子跳跃(SE)、可变5’剪接位点(A5SS)、可变3’剪接位点(A3SS)和互斥外显子(MXE)。本研究在2组比较组中均检测到差异可变剪接(DAS)。ST_vs_C组 and LT_vs_C组组分别鉴定出289和328个DAS(图5)(FDR<0.05)。SE和A3SS是最主要的DAS类型(>67%)。
在ST_vs_C组的975个DEG中,8个基因具有DAS。LOC104904993同时具有SE和MXE,LOC104906608只有A3SS。余下6个DEG存在A5SS或SE。在LT_vs_C组的383个DEG中,16个具有DAS。LOC104887494、LOC104892625、LOC104897720和LOC104907230均含有A3SS,LOC104902686 and LOC104902680有A5SS和SE。剩余DEG主要含有A3SS或RI。
与碱胁迫和碳同化相关的DEG
许多碱诱导的DEG在氧化还原过程中显著富集。例如,D-3-磷酸甘油酸脱氢酶1基因LOC104901403、亚油酸13S-脂氧合酶2-1基因LOC104889933和2-氧异缬氨酰化脱氢酶亚基α1 LOC104895418在ST_vs_C组中显著上调(表3)。相反地,谷氨酰基-tRNA还原酶1基因LOC104905095在ST_ vs_C组和LT_vs_C组中均下调。这些结果说明,甜菜的氧化还原反应显著地受到碱毒害的影响。另外,在脂质代谢过程中,LOC104901567 (脂肪酸过氧化氢酶) 和LOC104900797 (Ω-6 脂肪酸去饱和酶)等基因在碱毒害下表达水平显著下调,表明脂质代谢支持了甜菜抵御碱胁迫。植物激素信号传导和离子平衡在植物碱耐受中具有重要作用。在本研究的转录组数据中,ST_vs_C组的乙烯不敏感蛋白2基因LOC104884677和LT_vs_C组中的金属耐受蛋白11基因LOC104886952同时上调表达2倍以上。
碳同化在植物生长发育过程中有重要作用。本研究中,许多DEG在碳固定通路上有显著富集。其中,镁螯合亚基Ch1I基因LOC104900584在ST_vs_C组和LT_vs_C组中均有显著下调表达。编码磷酸海藻糖磷酸酶A(LOC104906608)、果糖二磷酸醛缩酶(LOC104895124)和蔗糖合酶(LOC104901675)基因的表达水平在ST_vs_C组或LT_vs_C组中下调超过2倍。总体而言,结果表明甜菜碳同化显著受到碱毒害的限制。
图5 两个比较组中的差异可变剪接(DAS)事件。a ST_vs_C;b LT_vs_C。蓝色柱形为上调的DAS,红色柱形为下调DAS。
表3 一些参与了碱胁迫应答和碳代谢的DEG
未注释DEG
共有32个拥有完整开放阅读框(ORF)的基因在Genbank中无注释,且它们的表达水平在胁迫下发生变化。例如,假定蛋白LOC104897954在LT_vs_C组中上调表达超过16倍。这说明许多未知基因可能参与了碱胁迫耐受。
qRT‑PCR 验证
为确认Illumina的RNA测序结果的精确性和重现性,研究人员以定量实时PCR(qRT-PCR)验证碱处理前后8个代表性基因的表达水平。所选基因的相对表达量进一步与RNA测序结果比较。qRT-PCR结果中,基因表达模式的相对趋势与RNA测序的结果一致,支持了RNA测序结果的可靠性。(图6)
图6 RNA测序结果与基因表达水平的qRT-PCR分析。a ST_vs_C 中,8个基因的Log2变化倍数;b LT_vs_C 中,8个基因的Log2变化倍数。
讨论
碱性是一种具有高度胁迫性的环境因子,限制了植物的生长繁殖。碱胁迫和盐胁迫常具有内在联系,会引发混合效应,如渗透性、专性离子和高pH效应,而且难以控制和改变。因此,阐明植物碱耐受机制、培育一系列新型耐盐碱作物,对于改良盐碱土壤乃至实现粮食增产,都是很有必要的。甜菜被人们持续广泛地作为作盐生作物栽培,是相对耐碱性的作物。近年研究通过形态学、生理学和分子响应等方面为植物胁迫耐受分子机制提供了有价值的信息。但关于甜菜的对碱性毒害耐受的分子机制未见报道。
理解甜菜碱性胁迫的调控网络,或许有助于发现增加藜属植物及其他植物耐碱性的新方法。而且,通过RNA测序进行详细的转录组分析可以用于厘清植物体内碱性响应基因表达的调控以及耐碱机制。植物对碱性胁迫的响应涉及到了伴随基因表达变化的复杂网络。因此,为能够更深刻地理解基因层面的变化,研究者对三种实验条件下(对照、短期碱性胁迫、长期碱性胁迫)的甜菜使用转录组分析。统计分析表明,共有25507个基因在3组甜菜样品中有表达。进一步从配对组中筛选基因表达水平具有巨大差异且p<0.05的DEG,最终选出了1270个重要的碱性响应基因。
GO富集分析被用于揭示GO term的富集偏好和DEG的假定功能注释。GO富集分析显示,DEG富集到了对刺激或胁迫响应方面,如对氧化压力、金属离子、革兰氏阴性菌、药物刺激、化学胁迫、DNA损伤刺激和生物性刺激等。与盐分胁迫类似,碱性胁迫也是一种典型的非生物胁迫,DEG在刺激、胁迫term上的富集也说明,所选择的DEG可能是实际上的碱性胁迫DEG。根据本研究中的转录组GO分析结果,DEG主要与氧化还原和脂质代谢有关。例如,D-3-磷酸甘油酸脱氢酶1基因LOC104901403、亚油酸13S-脂氧合酶2–1基因LOC104889933和2-氧异缬氨酰化脱氢酶亚基α1 LOC104895418均在ST_vs_C组中显著上调表达。相反地,谷氨酰-tRNA还原酶1基因LOC104905095在ST_vs_C组和LT_vs_C组均下调表达。此外,LOC104901567(脂肪酸脂氢过氧化物裂解酶)和LOC104900797(Ω-6脂肪酸去饱和酶)等脂质代谢过程中的基因的表达水平在碱性毒害下显著改变。这些结果说明,氧化还原和脂质代谢在甜菜的碱性胁迫耐受方面有关键作用。
KEGG富集分析可确认上述1270个重要的碱性响应DEG的相关通路。碳代谢是植物中最重要的代谢过程。碳同化保障了植物生长发育和胁迫应答的物质基础。本研究中,若干DEG富集到“光合器官中的碳固定”通路,进一步阐明了碱性胁迫对植物碳同化的抑制作用。而且,一些DEG在“乙醛酸和二羧酸代谢”通路中富集,说明了次生代谢可能参与了甜菜的碱性胁迫耐受。
碱性毒害可激活植物中激素依赖性信号通路并诱导激素生物合成基因表达。在非生物胁迫应答中,乙烯信号会与他激素发生串扰。Win等人发现,内源性乙烯水平影响植物生长和养分吸收。本研究中,ST_vs_C组乙烯不敏感蛋白2基因LOC104884677的表达水平显著上调,说明乙烯这一重要的光合激素信号传导元素在甜菜的碱性毒害响应中发挥了作用。日益增加的证据表明,维持芽中高K+/ Na+比的能力对植物碱性耐受至关重要。本研究中,LT_vs_C组的金属耐受蛋白11基因LOC104886952上调表达超过2倍。这说明甜菜中与离子平衡相关的基因被碱性条件激活。
近期研究发现,AS事件是普遍存在于植物中的重要调节机制。AS事件通常导致动植物体内产生多种蛋白,继而增加了生物多样性。人们注意到,一些由特定AS转录产生的蛋白,也和植物中的碱性胁迫应答有关。本研究中,ST_vs_C组和LT_vs_C组分别出现了8个、16个拥有DAS的基因。含有DAS的基因的出现,可能是甜菜用于节约能量的胁迫适应机制。因此,与DAS相关的基因可能在碱性胁迫适应中有重要作用。本研究中,DEG的AS类型主要为A3SS和SE。例如,碱性胁迫下,LOC104906608、LOC104897720和LOC104907230含有A3SS,LOC104904993和LOC104902680含有SE。上述结果表明,A3SS和SE可能在甜菜对碱性胁迫适应的过程中有重要作用。
此外,本研究转录组数据揭示了32个包含完整ORF的无注释基因在碱性胁迫下发生了上调表达。例如,假定蛋白LOC104897954在ST_vs_C组中上调了超过16倍,而LOC104906052在LT_vs_C组下调超过4倍。这些结果表明,以上无注释基因可能在甜菜的碱性胁迫耐受方面有重要作用。
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