Nat Med | 新型体外肿瘤片段平台解析患者对PD-1阻断的反应
撰文：huacishu
IF=53.441
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亮点：
1、作者开发并使用了一个病人来源的肿瘤片段平台来分析人肿瘤组织对PD-1阻断剂的早期免疫反应。
2、作者观察到免疫细胞在体外被重新激活的能力可以预测临床反应，并且分析确定肿瘤驻留的T细胞是这种免疫反应的关键组成部分。
荷兰癌症研究所Daniela Thommen教授团队在国际知名期刊Nat Med在线发表题为“An ex vivo tumor fragment platform to dissect response to PD-1 blockade in cancer”的研究论文。PD-1-PD-L1轴抑制剂已被批准用于许多人类癌症的治疗。尽管有证据表明PD-1具有广泛的临床活性，但对PD-1阻断后人类肿瘤组织发生的免疫改变却知之甚少。作者开发并使用了一个病人来源的肿瘤片段平台来分析人肿瘤组织对PD-1阻断剂的早期免疫反应。作者观察到免疫细胞在体外被重新激活的能力可以预测临床反应，并且分析确定肿瘤驻留的T细胞是这种免疫反应的关键组成部分。此外，通过基线特性和免疫应答能力的联合分析，作者发现了一个新的缺乏对PD-1阻断应答能力的浸润性肿瘤亚型。
为了评估人类癌症对PD-1阻断的早期免疫反应，作者使用患者源性肿瘤片段（PDTF）开发了器官型培养平台（图1a）。在这个平台上，手术切除的新鲜肿瘤组织被切割成约1mm3的碎片，目的是在保留肿瘤细胞结构的同时，提供足够的营养和试剂。为了评估PD-1阻断剂在不同人类癌症中的免疫反应，作者使用13种细胞因子分析了PD-1阻断剂对5种不同癌症类型（黑色素瘤、非小细胞肺癌（NSCLC）、乳腺癌、卵巢癌和肾细胞癌）的37种肿瘤的作用，13个趋化因子和4个T细胞活化标志物作为读数。该分析显示两组广泛的肿瘤：一个较大的组，仅显示轻微治疗引起所有评估参数的变化（37个肿瘤中有24个，以下称为PDTF非应答者（PDTFNRS）），以及一组较小的肿瘤（37个中的13个）在体外PD-1阻断（PDTF应答器（PDTF Rs））后免疫活性明显增强（图1b）。免疫应答组以黑色素瘤和非小细胞肺癌为主，但也有两例卵巢癌。主成分分析（PCA）导致PDTF-NR和PDTF-R样本之间的相似划分，并根据不同的反应模式指示PDTF-R肿瘤的进一步细分（图1c）。为了进一步了解体外PDTF应答与临床应答之间的关系，研究评估了另外一组26名具有匹配临床应答数据的患者，包括12名对临床PD-1阻断无应答的患者的黑色素瘤和NSCLC病变。对于三名出现混合反应的患者，三分之二的患者出现了免疫反应。对于23名获得部分或完全应答（n=5）或显示稳定或进行性疾病（n=18）的患者，所有病例的临床结果与免疫应答完全一致（图1d）。以上数据共同表明，抗PD-1治疗的临床反应与肿瘤驻留免疫细胞被PD-1–PD-L1通路阻断激活的能力相关。
先前的研究为T细胞在PD-1阻断抗体活性中的作用提供了证据，并且PD-1在人类肿瘤反应性T细胞上的高水平表达符合这个模型。然而，目前尚不清楚肿瘤驻留的T细胞是否能被PD-1阻断激活，或者治疗是否如最近所建议的那样主要激活外周T细胞。对T细胞活化标记物以及T细胞效应细胞因子白细胞介素-2（IL-2）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和IFN-γ的分析显示，在PDTF-R肿瘤中，在体外PD-1阻断后可检测到增加（图2a）。PD-1阻断进一步诱导PDTF-R肿瘤中多种细胞毒性标记物的释放，包括穿孔素、颗粒酶A和B以及颗粒溶素，这提示肿瘤内细胞毒性T细胞或自然杀伤（NK）细胞反应的再激活（图2b，c）。重要的是，PD-1阻断不仅增加了直接反映T细胞活化的参数，如CD137表达、IL-2和IFN-γ产生，而且增加了IFN-γ靶分子，如CXCL9和CXCL10趋化因子。此外，一系列其他趋化因子（包括CXCL1、CXCL5、CCL17和CCL20）的诱导与应答显著相关（图2d、e）。值得注意的是，淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶抑制剂的加入阻止了大多数参数的抗PD-1诱导的免疫再激活（图2f）。此外，PDTF-R肿瘤中淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶的抑制不仅消除了PD-1阻断后的免疫活性，而且使免疫活性降低到稳态时的水平以下（图2g，h）。总之，这些数据证明PD-1阻断后的免疫再激活在很大程度上依赖于肿瘤驻留的T细胞。
为了研究PD-1阻断对人类肿瘤免疫应答的差异是否可以用不同的免疫环境来解释，作者首先用流式细胞术定量检测了免疫细胞组分。这显示了一个亚组的肿瘤（37例中的10例，27%）缺乏实质性的免疫间隔（<10%的免疫细胞）。与预期一致，10个肿瘤中有0个被鉴定为PDTF-R（图3a，b）。在剩下的27个肿瘤中，观察到无反应和有反应的肿瘤具有相当大小的免疫细胞室，后者中B细胞富集（图3a）。为了了解肿瘤细胞内外CD8 T细胞的存在是否可用于进一步识别对PD-1阻断有反应的肿瘤，对肿瘤和间质区域的CD8 T细胞进行了数字图像分析（图3c）。虽然CD8 T细胞在间质区域更为丰富，并且总数量在不同类型的癌症中有所不同，但可以确定不同的空间模式。重要的是，在富含免疫细胞的肿瘤中，该分析确定了7个肿瘤具有排除的CD8 T细胞，其中CD8 细胞存在于间质区域，但在肿瘤区域内不存在或数量非常少。值得注意的是，七分之六的肿瘤在PD-1阻断后没有显示免疫再激活（图3c）。对未经治疗的PDTF培养48小时后细胞因子和趋化因子产生的分析显示，与CD8 浸润的PDTF-NR肿瘤相比（图3d，e），PDTF-R肿瘤的基线活性升高。基线产生预测PD-1阻断免疫再激活能力的参数包括CXCL9和CXCL10等分子，这些分子可能反映低水平的基线T细胞活性，但也包括与TLS形成相关的趋化因子CXCL13（图3f，g）。
由于肿瘤微环境中持续的抗原刺激和免疫抑制刺激可诱导T细胞的进行性功能障碍状态，伴随着多个免疫检查点的过度表达，接下来研究了抑制性受体的表达是否可预测PD-1阻断后免疫再激活的能力。为此，研究评估了CD8 T细胞上PD-1、CTLA-4、Tim-3、Lag-3和具有Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体（TIGIT）的表达（图4a）。PDTF-R与浸润或排除PDTF-NRs的抑制性受体阳性细胞比例无显著差异，但在PDTF-R肿瘤中TIGIT表达更为频繁。令人惊讶的是，少数T细胞上几个免疫检查点的频繁高表达（图4b）。此外，CD8 T细胞显示多个免疫检查点的共表达（图4c）。为了了解PDTF-R和PDTF-NR肿瘤之间是否存在功能前和功能失调亚群的差异，对PD-1 CD8 T细胞池中的TCF-1 和CD39 细胞进行了定量。与先前的数据一致，TCF-1在一部分T细胞中表达，这些T细胞表现出中等的PD-1表达水平，而CD39则大多为阴性。相反，CD39 亚群主要是TCF-1− PD-1的表达水平非常高（图4d）。TCF-1 前体功能群可在排除型和浸润型肿瘤微环境中确定，而无反应性和无反应性肿瘤之间的差异（图4e）。然而，前功能亚群和功能失调亚群之间的平衡强烈地偏向后者，这表明这些肿瘤中的一部分可能缺乏前功能亚群（图4e，f）。
为了了解这些T细胞亚群的患病率是否与PD-1阻断的免疫应答能力相关，对不同肿瘤微环境亚群中的CD39 CD103 和PD-1T CD8 T细胞亚群进行了量化（图5a，b）。值得注意的是，尽管组织驻留标记物CD103的表达在肿瘤微环境亚组之间具有可比性，但在PDTF-R中，CD39 CD103 双阳性细胞在CD8 T细胞中的比例最高，而根据先前的研究，CD103与PD-1阻断反应相关；对PD-1T TIL进行了类似的观察（图5c）。为了直接检测肿瘤特异性T细胞的存在，从5个PDTF-R和6个PDTF-NR肿瘤中分离和扩增CD3 TIL，并通过与自体肿瘤消化物共培养来测定肿瘤反应性（图5d）。值得注意的是，在所有从PDTF-R肿瘤获得的TIL中，5例中有4例检测到CD8 TIL间的肿瘤反应性和CD4 TIL间的肿瘤反应性。在PDTF-NR肿瘤中，六个肿瘤中只有一个检测到CD8 TIL和CD4 TIL之间的肿瘤反应性（图5d）。
以上分析共同表明，肿瘤对PD-1阻断的反应能力可能与T细胞浸润的程度以及具有肿瘤反应性T细胞表型特征的T细胞的频率有关，如PD-1高表达或CD39/CD103共表达。基于这两个独立的观察结果，随后探讨了PD-1T TIL绝对数量的预测价值，从而将肿瘤驻留T细胞的数量和质量结合在一个单一指标中。PD-1TCD8 T细胞、PD-1TCD4 T细胞和总PD-1TCD45 淋巴细胞在有反应的肿瘤中均增加（图6a–c），其中PD-1T淋巴细胞在PDTF-R和所有其他独立于癌症类型的肿瘤微环境类型之间表现出最好的区分。因此，随后评估TLS或其成分的存在是否与肿瘤对PD-1阻断的反应能力有关。通过CD20和CD3染色对PDTF-R和PDTF-NR肿瘤中的TLS进行定量（图6d）显示，PDTF-R肿瘤中的TLS数量和大小（定义为平均TLS面积）均显著高于浸润性PDTF-NR肿瘤（图6e）。值得注意的是，作为TLS主要成分的B细胞在PDTF-R肿瘤中也显著富集（图6f）。为了比较本研究中评估的所有参数预测肿瘤内免疫对PD-1阻断反应能力的潜力，作者分析了PD-1T淋巴细胞、CXCL13、B细胞、TLS数量和TLS面积的AUC（受体操作特征（ROC））。所有这五个参数都与抗PD-1反应能力密切相关，达到AUC≥0.84（图6g），表明识别PD-1检查点抑制肿瘤内免疫活性的人类肿瘤的可能性很高。
在这项研究中，作者综合分析了5种不同类型的人类肿瘤对PD-1阻断的早期肿瘤内免疫反应，以及预测这种反应的肿瘤特性。使用PDTF系统作为干扰肿瘤微环境的方法，观察到在不同类型的癌症中，抗PD-1治疗后24-48小时内已经可以检测到这种免疫反应。重要的是，这些数据提供了肿瘤内免疫再激活能力与临床反应密切相关的证据。
教授介绍
Daniela Thommen教授曾在瑞士接受内科和肿瘤内科的培训，并于2015年获得瑞士和欧洲委员会的肿瘤内科认证。作为肿瘤学家的同时，在巴塞尔生物医学系Alfred Zippelius教授的实验室担任研究员。她的研究主要集中在肿瘤内T细胞异质性在人类肺癌免疫检查点阻断反应中的作用。2016年加入了荷兰癌症研究所的Ton Schumacher教授的实验室，并获得瑞士国家科学基金会的博士后奖学金。在这里她继续研究肿瘤内免疫活性的异质性，并开发了人体肿瘤外植体模型，以研究患者特异性免疫治疗的体外反应。Daniela Thommen教授还在国际权威期刊cancer cell、ReviewNat Rev Cancer、Nat Med上发表了多篇文章，主持撰写了多部相关专业著作。
参考文献
Voabil P, de Bruijn M, Roelofsen LM, et al. An ex vivo tumor fragmentplatform to dissect response to PD-1 blockade in cancer [published online aheadof print, 2021 Jul 8]. Nat Med. 2021;10.1038/s41591-021-01398-3.doi:10.1038/s41591-021-01398-3