游离DNA在肾移植术后无创领域的最新进展

2020-02-10 11:23

目前肾移植是治愈终末期肾脏疾病的主要途径。截至2018年底全国累计肾移植例数已超16.5万例。随着现代免疫抑制剂的使用，移植配型技术的发展，术后移植肾短期存活率较前有明显提升，但是长期存活仍不容乐观。现阶段导致移植肾功能丧失最主要的原因仍然为急慢性排斥反应。随着移植术后时间的延长，移植肾累计排斥反应发生率不断增加，研究显示术后生存期1年以上受者急性排斥(acute rejection，AR)的发生率约8 %，生存期5年以上受者发生急性排斥反应的比例约为17 %[1]，而慢性排斥反应尤其是慢性体液性排斥反应随着时间延长发生率逐渐增加。早期发生的排斥反应在治疗效果、排斥逆转、预后等方面均显著优于晚期发生的排斥反应[2]，而对排斥反应做到早期诊断是治疗成功的关键。

供者来源游离DNA(donor-derived cell-free DNA，ddcfDNA)是指器官移植术后供者循环体液中来自于凋亡或坏死供体细胞的游离DNA，其带有供者组织的细胞信息。近两年来ddcfDNA迅速成为移植肾损伤检测领域的研究热点，集中数据成果发表让肾移植领域对ddcfDNA在移植肾损伤特别是急性排斥方面的认识不断深入，为推动ddcfDNA成为未来肾移植排斥无创检测的生物标记物奠定了理论基础。本文综述了ddcfDNA在移植肾缺血再灌注(ischaemia-reperfusion injury，IRI)损伤、移植肾功能延迟恢复(delayed graft function，DGF)、不同类型急性排斥反应(体液性排斥和细胞性排斥)和多瘤病毒相关性肾病(BKV associated nephropathy，BKVAN)等领域的研究进展，讨论目前研究数据和研究模式的不足，同时提出下一步的研究方向。

一、术后早期ddcfDNA的浓度变化

IRI是肾移植手术中不可避免的问题。研究显示血浆ddcfDNA水平在肾移植术后血管开放后的3 h中位浓度达到20.69 %，然后浓度以"L"型曲线下降[3]，至术后9.85 d后平均达到0.46 %[4]，血浆ddcfDNA浓度在心脏死亡器官捐献(donation after cardiac death，DCD)供者移植中(44.99 %)显著高于亲属活体肾脏捐献(living donor renal transplantation，LDRT)供肾(10.24 %，P＝0.004)[3]，表明IRI会增加血浆中ddcfDNA，IRI严重的受者术后ddcfDNA的起始浓度更大。

死亡后器官捐献供者生前往往存在长时间低血压、低血氧和严重感染等情况，常导致供肾的急性损伤(acute kidney injury，AKI)。供肾AKI将极大可能导致移植受者发生DGF，临床上约10 %～40 %的肾移植受者术后会发生DGF[5,6,7,8]。术后预测DGF发生有利于临床的早期鉴别诊断与治疗，术后早期ddcfDNA升高主要由IRI引起，发生DGF和non-DGF受者术后ddcfDNA水平差异无统计学意义(P＝0.89)[3]。有研究表明，供者来源的线粒体DNA(donor mitochondrial DNA，dmtDNA)水平可作为DGF发生的标志物[9]，DGF受者移植肾发生排斥的风险比non-DGF受者增高1.5倍[10]。术后早期DGF导致的血清肌酐水平升高和少尿症状与急性排斥反应相似，在临床上难以区分，但治疗方式不同，因此术后早期鉴别诊断移植肾DGF和急性排斥反应对及时有效干预有重要意义。DGF受者与急性排斥反应受者的ddcfDNA在术后早期也以相同趋势下降，当DGF受者血浆ddcfDNA浓度在术后早期下降过程中出现反跳升高(>1 %)，提示可能会发生急性排斥反应[3]。目前对于ddcfDNA用于早期鉴别诊断DGF和AR的研究数据不多，未有定论。

二、ddcfDNA在AR受者中的研究

1．AR与稳定组受者血浆ddcfDNA差别

通过与移植肾组织病理活检结果进行病例-对照研究(case-control study)，近两年ddcfDNA在肾移植AR诊断的研究数据越来越多，全球近10个团队在开展这个领域的工作。目前研究认为，血浆中ddcfDNA浓度为1 %时可作为AR受者和稳定组受者的阈值。2017年美国CareDx公司主导的多中心研究表明ddcfDNA在AR受者血浆中的浓度中位数为1.6 %，高于稳定组受者的0.3 %(P<0.001)，以ddcfDNA>1 %用于诊断AR时，曲线下面积(area under the curve，AUC)为0.74，阳性预测值(positive predictive value，PPV)为61 %，阴性预测值(negative predictive values，NPV)为84 %。Sigdel等对300份血浆样本[38例急性排斥反应(AR)、72例临界排斥反应(BL)、82例稳定同种异体移植物(STA)、25例其他损伤(OI)]检测ddcfDNA，结果表明AR(2.3 %)高于BL(0.6 %)、OI(0.7 %)和STA(0.4 %)，差异均有统计学意义(P<0.0001)，利用ddcfDNA>1 %作为阈值来诊断AR，敏感度可达到88.7 %，特异性达到72.6 %，AUC为0.87[11]。已有研究主要集中在分析ddcfDNA检测AR的最优阈值(cut off)方面，显示ddcfDNA作为AR诊断生物标志物的巨大潜力，然而靠ddcfDNA单一指标的阈值来划分AR和稳定组受者的临床意义具有局限性。基于ddcfDNA检测并结合其他临床指标预测AR发生风险度的研究模式，将更科学准确。

2．不同AR类型受者血浆ddcfDNA变化

不同AR类型的受者中ddcfDNA浓度不同，多项研究表明抗体介导排斥反应(antibody mediated rejection，AMR)受者与稳定组受者在血浆ddcfDNA浓度上的差异有统计学意义，但对于T淋巴细胞介导的排斥反应(T-cell mediated rejection，TCMR)受者与稳定组受者在血浆ddcfDNA浓度上的差异研究还未达成一致结果[8,11,12,13]。研究表明ddcfDNA并不能区分TCMR组受者(0.27 %)与稳定组受者(0.38 %)，特别在I级TCMR受者中，AMR受者血浆中的ddcfDNA平均浓度(2.9 %)高于TCMR受者(>IA级，1.2 %)[14]。然而也有研究表明AMR(2.2 %)、TCMR(2.7 %)和AMR合并TCMR(2.6 %)组间差异无统计学意义[11]。因此目前研究表明利用血浆ddcfDNA检测TCMR，结果准确性低于检测AMR。有研究报道ddcfDNA浓度结合供者特异性抗体(donor's specific antibody，DSA)检测可以提高诊断AMR的阳性预测值(PPV＝81 %和PPV＝44 %)和阴性预测值(NPV＝83 %和NPV＝96 %)，远高于单独DSA诊断AMR的阳性预测值(PPV＝48 %)[12,13]。不同类型的排斥反应有不同的医疗处置对策和预后，如TCMR通常需要针对T淋巴细胞的药物如激素、抗胸腺球蛋白(ATG)等治疗[15]；而AMR需要针对B淋巴细胞、浆细胞等产生抗体的细胞药物如利妥昔单抗、硼替佐米等治疗[16,17]。因此对于排斥风险的分级和排斥类型的准确鉴别，多指标判断比用单一指标划分排斥风险阈值更科学准确。

血浆ddcfDNA浓度在不同类型AR受者中的研究结果提示不同损伤部位引起的血浆ddcfDNA浓度升高也有差异，AMR主要造成的是微血管损伤，其造成血管内皮细胞凋亡后产生的cfDNA可以直接进入循环血液。然而TCMR特别是Ⅰ级排斥反应，主要损伤部位是肾小管间质，小管上皮细胞入血则需要跨过血管屏障。对于TCMR中IB级以上排斥(伴有动脉炎)，已有研究结果也表明血浆ddcfDNA升高明显[12]。对于排斥反应类型的进一步鉴别需要利用多维样本(尿液和血液)中的ddcfDNA信息来分析不同损伤部位(小管上皮细胞或血管内皮细胞)[18]。另外其它具有组织特异性的表观遗传学特征，如cfDNA甲基化、cfDNA核小体图谱、miRNA和LncRNA等，在将来不同排斥反应损伤部位的研究中具有巨大潜力[19,20,21,22]。

3．AR治疗后ddcfDNA浓度动态变化

cfDNA的半衰期非常短，因此ddcfDNA预期可以反映受者治疗后的实时状态。目前对AR治疗后ddcfDNA浓度的动态变化研究数据还比较少。3例AR受者治疗的研究表明ddcfDNA有潜力作为治疗效果评估的实时生物标志物；2例TCMR受者(IA级TCMR受者和早期临界TCMR受者)在接受甲泼尼龙(methylprednisolone)治疗后，其中1例ddcfDNA浓度从治疗的1.3 %下降到治疗周期结束时的0.42 %；另1例从治疗前的3.5 %到治疗第2天下降至0.49 %；1例C4d阳性的AMR受者在接受激素冲击和血浆置换治疗后，ddcfDNA浓度从治疗前的2.6 %，下降到治疗周期结束时的后1 d的0.67 %(血浆置换影响ddcfDNA水平，因此建议等待1 d后采样检测)[23]。AR治疗后血浆ddcfDNA浓度迅速下降(<2 d)，表明ddcfDNA可以作为排斥反应治疗预后的指标。但ddcfDNA在AR受者治疗后的动态变化规律，还需要更多的研究数据。

4．亚临床排斥反应与ddcfDNA

ddcfDNA在亚临床排斥反应(subclinical rejection，SR)方面的研究报道不多。13例程序性活检并确诊为AR受者中12例受者的血浆ddcfDNA显示阳性(>1 %)，PPV为92 %[11]，表明ddcfDNA在肾移植SR预测有重要意义。最近美国14个肾移植中心开展的"DART"研究(NCT02424227)，验证ddcfDNA在肾移植亚临床排斥方向上的应用(https：//www.clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT02424227？term＝transplantation&cond＝cell＋free＋DNA&rank＝4)。

三、ddcfDNA在其他肾损伤或移植类型中的研究

1．BKVAN与ddcfDNA

约1 %～10 %的肾移植受者会发生BKVAN，一旦发生BKVAN，有10 %～80 %的受者最终会出现移植肾功能丧失[24]。单纯的BKV感染受者和BKVAN受者在临床治疗上是不同的，目前基于尿液或血液的BKV负荷检测，对BKVAN的预测价值有限。已有研究表明BKV感染会引起尿液中总cfDNA的升高[25]，对少量BKVAN受者的血浆ddcfDNA研究结果显示，BKVAN受者与稳定组受者血液中的ddcfDNA浓度差异无统计学意义[12]。目前还未有专门对BKVAN受者中ddcfDNA浓度的系统研究报道。BKV在发病前期主要潜伏于尿路上皮细胞，激活后才进入小管上皮甚至管周毛细血管，引起宿主细胞凋亡。凋亡的cfDNA是否进入血液循环系统是血液中检测到ddcfDNA浓度的关键，将来的研究需要把BKVAN的病理类型进一步细分，对无差异的血浆ddcfDNA浓度进行分组分析。另外，ddcfDNA的初期感染主要在小管上皮细胞，对BKVAN受者中的研究样本类型可以从血液扩大到尿液样本。

2．多次肾移植与ddcfDNA

多次肾移植受者血浆中ddcfDNA浓度的中位数(0.29 %)高于单次肾移植受者，差异有统计学意义(0.19 %，P<0.001)，多次肾移植急性排斥反应受者血浆ddcfDNA浓度(1.36 %)也高于稳定组受者(0.41 %，P＝0.009)，但与单次肾移植排斥反应受者之间差异无统计学意义(P＝0.85)[26]，表明在多次肾移植中血浆ddcfDNA检测排斥反应也是可行的。

3．受者感染对ddcfDNA的影响

感染是否影响受者血浆中ddcfDNA还未有明确结论。5例BKV感染和6例血管球性肾炎受者的研究显示，其中3例BKV感染受者和2例血球形肾炎受者血液中ddcfDNA浓度与AR时浓度差异无统计学意义[12]。对21例肾移植感染受者(8例脓血症、4例尿路感染、2例呼吸道感染、5例局部感染、1例CMV感染和1例念珠菌感染)ddcfDNA浓度的研究表明21例受者血浆中ddcfDNA浓度升高且高于稳定组，与AR组间差异也有统计学意义(P＝0.025)；另外4例BKVAN的受者尿液中cfDNA浓度的研究表明BKVAN尿液中ddcfDNA浓度升高，差异有统计学意义(P<0.0001)，而与AR组间差异无统计学意义(P＝0.98)[27]。目前感染受者体液中ddcfDNA的变化模式还不清楚，影响ddcfDNA在临床的进一步应用。

ddcfDNA对移植肾损伤的预测价值已经显示出巨大的临床应用潜力，但目前的理论支持数据较少，需要更多的研究工作。由于目前ddcfDNA研究技术平台不统一，包括目标区域杂交捕获测序、多重PCR(多重聚合酶链式反应)测序和数字化PCR等，不同的ddcfDNA定量方法对检测值有一定影响。而对于定量方法学的准确性验证，是该方法进入临床样本实验的前提。目前研究还未有对ddcfDNA定量方法本身可靠性的严谨验证数据，各研究团队在保护知识产权方面采取的措施客观上阻碍了ddcfDNA的多中心研究。最新研究显示，通过采集受者外周血同时检测AR和感染情况，显示出了更大的临床应用潜力，但对检测的技术方法本身也提出了更高的要求[28]。

目前，国际国内均已出现通过供体来源游离DNA来检测术后排斥的机构，自2018年临床应用以来, 目前在国外肾移植中心已常规开展, 累计检测患者数超过15万例，国内的奥根诊断（Allodx）也已经与多个医院移植中心展开临床合作，并建立了4000+份样品“中国器官移植液体活检”。

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