溶剂残留方法学验证

一、概述

药物中的残留溶剂系指在原料药或辅料的生产中、以及在制剂制备过程中使用或产生而又未能完全去除的有机溶剂。根据有机溶剂对人体及环境可能造成的危害的程度， ICH将有机溶剂分为避免使用、限制使用、低毒和毒性依据尚不足四种情况。因残留溶剂会影响产品的安全性，故需对其进行研究。

二、研究方法的建立及方法学验证

在确定了需要进行残留量研究的溶剂后，需要通过方法学研究建立合理可行的检测方法。目前，残留溶剂的测定一般采用气相色谱法，推荐使用毛细管色谱柱-  顶空进样系统，当然也可以使用普通填充柱，溶液直接进样方法。对不宜采用气相色谱法测定的含氮碱性化合物，如N- 甲基吡咯烷酮等可采用其它方法，如离子色谱法等。

GC法具有检测灵敏度较高，选择性较好的特点，采用此法所需的样品用量较少，基本可以满足所有残留溶剂测定的要求。采用GC法时，需要结合药物和所要检测的溶剂的性质，通过方法学研究确定合适的检测条件。

1、方法的建立

1.1 确定被测的有机溶剂

根据制备工艺确定被测有机溶剂的范围。通常应对制备工艺过程中使用的二类以上溶剂和重结晶用溶剂，以及根据工艺特点要求的其它溶剂进行残留量的研究。建议对合成最后三步使用的三类溶剂也进行研究，这样能更好地对未知峰进行归属；对制剂过程中使用的有机溶剂也建议考察其残留情况，特别是缓、控释微丸包衣过程使用的有机溶剂更应引起注意。

1.2 色谱柱选择

按照相似相溶的原理选择色谱柱。毛细管柱有极性柱、非极性柱、弱极性柱和中等极性柱。填充柱有高分子多孔小球或涂渍适宜固定液的填充柱。测定含氮的碱性有机溶剂时，由于普通气相色谱仪的不锈钢管路、进样器衬管等对有机胺等含氮的碱性化合物具有较强的吸附作用，致使其检出的灵敏度降低。通常采用弱极性色谱柱或经碱处理过的色谱柱分析含氮的碱性有机溶剂，如果采用胺分析专用柱进行分析，则效果更好。

1.3 进样方法

GC 法包括溶液直接进样和顶空进样两种进样方法。通常情况下，沸点低的溶剂建议采用顶空进样法，沸点高的溶剂可以采用溶液直接进样法，当样品本身对测定有影响时，也建议采用顶空进样法。

1.4 供试品溶液和对照品溶液的配制

对于固体原料药，如采用溶液直接进样法，需先用水或合适的溶剂使原料药溶解，以使其中的有机溶剂释放于溶液中，才能被准确测定。如采用顶空进样法，通常以水作溶剂；当药物不溶于水，但可溶于一定浓度的酸或碱液中时，可采用不挥发的酸或碱液为溶剂，但不能使用盐酸溶液或氨水；对于非水溶性药物，可采用合适的溶剂,如N,N—二甲基甲酰胺、二甲基亚砜等为溶剂。以DMSO  等为溶剂时，可加入一定量的水以增加检测的灵敏度，或用盐析的方法增加灵敏度。

1.5 供试品溶液和对照品溶液浓度的确定

配制供试品溶液的浓度应满足定量测定的需要，一般供试品取样量在0.1 ~1g之间。限度检查时对照品溶液的浓度可按规定的限度配制，定量测定时按实际残留量配制，浓度相差最好以不超过 2  倍为宜。

1.6 检测器的选择

一般选用FID检测器，对含卤素的有机溶剂如氯仿等，采用  ECD检测器可得到更高的灵敏度。通常可根据药物溶剂的残留情况选择合适的检查方法。当需要检查的有机溶剂数量不多，且极性差异较小时，可选择毛细管色谱柱 -  顶空进样-等温法。当需要检查的有机溶剂数量较多，且极性、沸点差异较大时，可选择毛细管色谱柱  -顶空进样-  程序升温法；也可选择填充柱或适宜极性的毛细管柱直接进样法。

1.7 顶空进样法还要对顶空温度和顶空时间进行选择

顶空温度应根据溶解供试品溶剂的特性及供试品中残留溶剂的沸点选择。以水为溶剂及测定低沸点残留溶剂时，顶空温度不宜超过85 ℃；测定沸点较高的残留溶剂时，通常选择较高的顶空温度；但此时应兼顾供试品的热分解特性，尽量避免供试品产生的挥发性热分解产物干扰测定结果。以  DMSO为溶剂时，顶空温度不宜超过115  ℃。例如，在申报资料中发现，以水为溶剂，顶空温度为100 ℃，柱温  60℃，结果高浓度的乙腈比低浓度的二氯甲烷的峰面积还小，原因是顶空温度太高，大量的水被蒸发（或浓度被稀释），随着水蒸汽的凝结，在水中溶解度大的乙腈的灵敏度下降，产生了与事实不符的实验结果。

顶空时间是要确保供试品溶液的气-液两相达到平衡，一般通过测定顶空时间与顶空气体浓度的浓度  —时间曲线来确定。顶空时间不宜过长，一般为30~45分钟，如果超过  60min ，可能引起顶空瓶的气密性变差, 导致定量的准确性降低。如果平衡时间选择 10分钟，就不能保证气- 液两相达到平衡。对照品溶液与供试品溶液必须使用相同的顶空条件。

2、方法学验证

2.1 系统适用性试验

柱效：用被测物的色谱峰计算，填充柱法的理论板数应大于1000 ，毛细管色谱柱的理论板数应大于  5000。

分离度：色谱图中被测物色谱峰与其相邻色谱峰的分离度应大于1.5  。

重复性：以内标法测定时，对照品溶液连续进样5次，所得被测物与内标物峰面积之比的相对标准偏差 (RSD)应不大于5%  ；以外标法测定时，所得被测物峰面积的相对标准偏差 (RSD)应不大于 10% 。

2.2 专属性

对各种残留溶剂定位和进行混合溶剂的分离度试验，分离度应大于1. 5 。同时空白溶剂对被测溶剂无干扰。

2.3 线性

至少制备6个浓度（如定限，10%，20%，40%，60%，80%，100%，120%残留溶剂限度水平），相关系数不小于0.99。

2.4 检测限和定量限

检测限为信噪比3～5时相应浓度或注入仪器的量。定量测定时需验证定量限，其限度为信噪比10～15时相应浓度或注入仪器的量。定量限应不高于残留溶剂限度的50%。

2.5 精密度

2.5.1 重复性

连续进样6次，标准溶液峰面积RSD不得大于10%。

2.5.2中间精密度

不同时间，不同实验人员，不同仪器，测得的供试品溶液中残留溶剂的峰面积RSD不得大于10%。

2.6 准确度

在规定的范围内，至少9个测定结果。设计三个不同的浓度（一般加入80%，100%，120%三个不同限度浓度的标准溶液）进行测定，计算回收率和相对标准偏差，回收率应在80%～120%，各浓度水平回收率的RSD应不大于2.0%。

2.7 耐用性

通过改变柱流速，初始柱温，色谱柱型号等，考察色谱参数的微小变化对结果的影响。