实验诊断-临床血液学检测：溶血性贫血的实验室检测

溶血性贫血的实验室检测

溶血性贫血的实验室检测

一、溶血性贫血的筛查检测

（一）血浆游离血红蛋白测定

1.参考值 <50mg/L（1～5mg/dl）

2.临床意义

（1）血管内溶血时血浆游离血红蛋白明显增高；

（2）血管外溶血时血浆游离血红蛋白不增高；

（3）自身免疫性溶血性贫血、珠蛋白生成障碍性贫血可轻度增高。

（二）血清结合珠蛋白测定

1.参考值 0.7～1.5g/L（70～150mg/dl）

2.临床意义

（1）各种溶血时血清结合珠蛋白均有减低，血管内溶血时减低显著；

（2）肝脏病、传染性单个核细胞增多症、先天性无血清结合珠蛋白血症等可减低或消失；

（3）感染、创伤、恶性肿瘤、系统性红斑狼疮、糖皮质激素治疗等可有结合珠蛋白增高。

（三）血浆高铁血红素清蛋白测定

   1.检测方法       生化法、电泳法

   2.正常值          阴性

   3.临床意义      阳性表示为严重血管内溶血

（四）含铁血黄素尿试验（Rous试验）

1.原理 铁离子在酸化的亚铁氰化钾溶液中生成蓝色的亚铁氰化铁，即普鲁士蓝反应。

2.正常值 阴性

3.临床意义

（1）慢性血管内溶血可呈现阳性，并持续数周；

（2）常见于阵发性睡眠性血红蛋白尿症，在溶血初期可阴性。

（五）红细胞寿命测定

1.原理      用⁵¹Cr标记红细胞检测红细胞半衰期。

2.正常值       正常红细胞半衰期为25～32天。

3.临床意义      溶血性贫血时常小于15天，这是确定溶血性贫血的可靠方法。

二、红细胞膜缺陷的检测

（一）红细胞渗透脆性试验

1.原理    红细胞在低渗氯化钠溶液中细胞逐渐膨胀甚至破裂而溶血。

2.参考值

Ø  开始溶血：0.42%～0.46%（4.2～4.6g/L）NaCl溶液

Ø  完全溶血：0.28%～0.34%（2.8～3.4g/L）NaCl溶液

3.临床意义

（1）脆性增高：  遗传性球形细胞增多症、温抗体型自身免疫性溶血性贫血、遗传性椭圆形细胞增多症等；

（2）脆性减低：  海洋性贫血、缺铁性贫血、某些肝硬化及阻塞性黄疸等。

（二）红细胞孵育渗透脆性试验

1.原理    红细胞孵育过程中，葡萄糖的消耗增加，贮备的ATP减少，导致红细胞膜对阳离子的主动传递受阻，钠离子在红细胞内集聚，细胞膨胀，渗透脆性增加。

2.参考值

未孵育：50%溶血为4.00～4.45g/L NaCl

37℃孵育24h：50%溶血为4.65～5.9g/L NaCl

3.临床意义

（1）脆性增加：遗传性球形细胞增多症、遗传性椭圆形细胞增多症、遗传性非球形细胞溶血性贫血等；

（2）脆性减低：珠蛋白生成障碍性贫血、缺铁性贫血、镰形细胞贫血等。

（三）自身溶血试验及纠正试验

1.原理    红细胞内酶缺陷，葡萄糖酵解障碍，不能提供足量ATP，以维持红细胞内的钠泵作用。病人红细胞无菌条件下在自身血浆中温育48小时，使ATP储备减少，钠泵作用减弱，导致溶血增强。在孵育过程中，分别加入葡萄糖和ATP作为纠正物，并以氯化钠溶液为对照，观察溶血是否能被纠正。

2.参考值

Ø  正常人红细胞经孵育48小时后，仅轻微溶血、溶血度<3.5%

Ø  加葡萄糖和加ATP孵育，溶血明显纠正，溶血度均<1%

3.临床意义

（1）遗传性球形细胞增多症时，孵育后溶血明显增强，加入葡萄糖及ATP后均得到明显纠正。

（2）Ⅰ型先天性非球形细胞性溶血性贫血（G6PD缺陷症）时自身溶血加重，加葡萄糖和ATP均可部分纠正。

（3）Ⅱ型先天性非球形细胞性溶血性贫血（丙酮酸激酶缺陷症）自身溶血明显增强，加葡萄糖不能纠正，加ATP才能纠正。

三、红细胞酶缺陷的检测

（一）高铁血红蛋白还原试验

1.原理    在被检血液中加入亚硝酸钠使血红蛋白变成棕色的高铁血红蛋白，当血液中有足量还原型辅酶Ⅱ（NADPH）时，棕色的高铁血红蛋白又被还原成亚铁型的血红蛋白。

2.参考值    高铁血红蛋白还原率>75%；高铁血红蛋白0.3～1.3g/L。

3.临床意义    减低：蚕豆病和伯氨喹型药物溶血性贫血病人由于G6PD缺陷，高铁血红蛋白还原率明显下降。

（二）氰化物-抗坏血酸试验

1.原理

Ø  抗坏血酸钠与HbO₂反应产生H₂O₂，氰化钠能抑制过氧化氢酶使H₂O₂不被分解，于是H₂O₂与还原型谷胱甘肽（GSH）发生反应，产生氧化型谷胱甘肽（GSSG），NADPH使GSSG再还原为GSH。

Ø  如红细胞中催化NADPH形成的G6PD酶缺陷，则GSH产生减少，蓄积的H₂O₂会把亚铁型的HbO₂氧化成棕色的高铁血红蛋白。

2.参考值

（1）正常人血液要在4小时以上才变成棕色；

（2）纯合子G6PD缺陷的血液变成棕色，在2小时内即变色，杂合子者要3～4小时变色。

（三）变性珠蛋白小体生成试验

1.原理

Ø  G6PD缺陷可致红细胞内的还原型谷胱甘肽（GSSG）含量减少，高铁血红蛋白增高，最后形成变性珠蛋白小体（Heinz bodies）。

Ø  取G6PD缺陷者血液，然后加乙酰苯肼于被检血样及对照标本中，37℃温育2～4小时，推薄血片，用1%煌焦油蓝染色。计算含5个或更多珠蛋白小体的红细胞百分率。

2.参考值 <30%

3.临床意义 G6PD缺陷病、不稳定Hb、HbH病等Heinz bodies常高于45%。

（四）葡萄糖-6-磷酸脱氢酶荧光斑点试验和活性测定

1.原理

G6PD使NADP还原成NADPH，后者在紫外线照射下会发出荧光。NADPH的吸收峰在波长340nm处，可通过单位时间生成NADPH的量来测定G6PD活性。

2.参考值      正常人有甚强荧光

3.临床意义

（1）G6PD缺陷者荧光很弱或无荧光；

（2）杂合子或某些G6PD变异体者则可能有轻到中度荧光。

（五）丙酮酸激酶荧光筛选试验和活性测定

1.原理

在ADP存在条件下，PK催化烯醇式磷酸丙酮酸变为丙酮酸，在NADH存在情况下，丙酮酸被LDH作用转变成乳酸，此时有自发荧光能力的NADH变为NAD，荧光消失。

2.参考值 PK活性正常，荧光在20分钟内消失。酶活性（15.1±4.99）U/gHb。

3.临床意义

（1）PK严重缺陷（纯合子）荧光60分钟不消失

（2）杂合子者荧光25～60分钟消失

四、珠蛋白生成异常的检测

（一）血红蛋白电泳

1.原理  

在一定的PH缓冲液中，缓冲液的PH大于Hb等电点，其带负电，在电场中向阳极移动；反之向阴极移动。

2.参考值 正常人的电泳图谱显示4条区带，最靠阳极端的为量多的HbA，其后为量少的HbA₂，再后为两条量更少的红细胞内的非血红蛋白成分（NH₁和NH₂）。

3.临床意义

（1）HbA₂增高  是诊断β轻型地中海贫血的重要依据

（2）HbA₂减低  缺铁性贫血及铁粒幼细胞贫血HbA₂减低

（二）胎儿血红蛋白酸洗脱试验

1.原理

HbF抗酸能力较HbA强。把经固定后的血涂片置酸性缓冲液中保湿一定时间，只有含HbF的红细胞不被洗脱，再用伊红染色而呈鲜红色。

2.临床意义

（1）脐带血、新生儿、婴儿阳性，成人小于1%

（2）地中海贫血病人轻型者（杂合子）仅少数红细胞呈阳性，重型者阳性红细胞明显增多

（三）胎儿血红蛋白测定或HbF碱变性试验

1.原理

在碱性溶液中，HbF不易变性沉淀，其他Hb在碱性溶液中可变性被沉淀。测定其滤液中Hb含量，即HbF含量。

2.参考值 成人<2%。新生儿55%～85%，1岁左右同成人。

3.临床意义

增高：β地中海贫血明显增高，重型者高达80%～90%。急性白血病、再生障碍性贫血、纯红白血病、淋巴瘤等也可轻度增高。

（四）HbA₂定量测定

1.参考值   1%～3.2%

2.临床意义    同血红蛋白电泳

（五）限制性内切酶谱分析

原理 :

从白细胞、胎儿的绒毛或羊水细胞提取高分子量DNA，用适当的限制性内切酶降解。经琼脂糖电泳分级，用Southern印迹法把DNA转移到硝酸纤维素膜上，再与同位素标记的基因探针杂交后放射自显影。根据病人DNA限制性内切酶图谱的变化或限制性内切酶降解DNA片段长度的多态性，来分析是否存在珠蛋白基因的突变、缺失等缺陷。

五、自身免疫性溶血性贫血检测

（一）抗球蛋白试验

1.原理

抗球蛋白抗体可与多个不完全抗体的Fc段相结合起链接或桥接作用，导致红细胞凝集可被观察到，称为抗球蛋白试验（Coombs test）阳性。

Ø  直接Coombs试验阳性说明红细胞表面已结合有不完全抗体。

Ø  间接Coombs试验阳性则说明病人血清中存在着不完全抗体。

2.参考值    直接、间接抗球蛋白均呈阴性反应。

3.临床意义

（1）阳性：新生儿溶血病、自身免疫性溶血性贫血、SLE、类风湿关节炎等。

（2）温抗体与冷抗体：AIHA大多属于温抗体型

（3）抗体亚型：AIHA大多为IgG型抗体

（4）间接Coombs试验：主要用于Rh或ABO妊娠免疫性新生儿溶血病、母体血清中不完全抗体的检测。

（二）冷凝集素试验

1.原理   

冷凝集素是一种可逆性抗体，在低温时可与自身红细胞、“O”型红细胞或与病人同型红细胞发生凝集，当温度增高时，凝集现象又消失。

2.参考值     效价<1∶40，反应最适温度为4℃。

3.临床意义     某些AIHA病人的冷凝集素效价很高，有的效价可达64000或更高。

（三）冷热溶血试验

1.原理

阵发性寒冷性血红蛋白尿症（PCH）病人的血清中有特殊溶血素，在0～4℃时，溶血素与红细胞结合并吸附补体，但不溶血，当升温至30～37℃则发生溶血。

2.参考值 阴性

3.临床意义

（1）阳性见于PCH。

（2）某些病毒感染如麻疹、流行性腮腺炎、水痘、传染性单个核细胞增多症也可有阳性反应。

六、阵发性睡眠性血红蛋白尿症有关检测

（一）蔗糖溶血试验

1.原理

蔗糖溶液离子浓度低，经孵育可加强补体与红细胞膜的结合，使PNH病人的红细胞膜上形成小孔，遂使蔗糖进入红细胞而导致溶血。

2.参考值 阴性

3.临床意义

（1）PNH常为阳性。

（2）轻度阳性亦可见于部分巨幼细胞贫血，AA，AIHA和遗传性球形细胞增多症。

（二）酸化溶血试验

1.原理

PNH病人的红细胞对补体敏感性增高，在酸化的血清中（pH6.6～6.8），经37℃孵育，会发生溶血。

2.参考值 阴性

3.临床意义

 阳性主要见于PNH，某些AIHA发作严重时也可阳性。

（三）蛇毒因子溶血试验

Ø  蛇毒因子是以眼镜蛇毒中提取的一种分子量为144 000蛋白质，它能直接激活血清中的补体C3，通过旁路途径激活补体系统，使PNH的红细胞溶血。

Ø  本试验为特异性PNH试验。

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