单细胞文献你不整理，过后甚至会忘记自己曾经读过
考虑到咱们生信技能树粉丝对单细胞数据挖掘的需求，我开通了一个专栏《100个单细胞转录组数据降维聚类分群图表复现》，也亲自示范了几个，不过自己带娃，读博，时间精力有限，所以把剩余的90多个任务安排了学徒，实习生，学员。真的是太棒了，群策群力！
我们的《单细胞文献100》活动激起了大家对单细胞的兴趣， 马上交流群有朋友咨询B细胞的细分亚群，希望给出参考文献，我恰好在看新冠病毒相关单细胞数据分析文章， 就给出来了这个：《Single-cell landscape of immunological responses in patients with COVID-19》
该研究的实验设计很清晰，就是 5 个正常人加上13个患者 的 血液进行单细胞转录组 ：
healthy donors (HDs) (n = 5), moderate (n = 7), severe (n = 4) convalescent (n = 6) samples
第一层次降维聚类分群
总共是 122,542 cells ，第一层次降维聚类分群是14个：
naive-state T (naive T) cells (CD3+CCR7+) activated-state T (activated T) cells (CD3+PRF1+) mucosal-associated invariant T (MAIT) cells (SLC4A10+TRAV1-2+) γδ T cells (TRGV9+TRDV2+) proliferative T (pro T) cells (CD3+MKI67+) natural killer (NK) cells (KLRF1+) B cells (MS4A1+) plasma B cells (MZB1+) CD14+ monocytes (CD14+ mono; LYZ+CD14+) CD16+ monocytes (CD16+ mono; LYZ+FCGR3A+) monocyte-derived dendritic cells (mono DCs; CD1C+) plasmacytoid dendritic cells (pDCs; LILRA4+) plate- lets (PPBP+) hemopoietic stem cells (HSCs; CYTL1+GATA2+).
其umap可视化如下所示：
这个配色其实不容易区分，虽然色彩很饱满。每个细胞亚群各自标志性基因的表达量展示，文章也做的很好，这里就不赘述。以前我们做了一个投票：可视化单细胞亚群的标记基因的5个方法，下面的5个基础函数相信大家都是已经烂熟于心了：
VlnPlot(pbmc, features = c("MS4A1", "CD79A")) FeaturePlot(pbmc, features = c("MS4A1", "CD79A")) RidgePlot(pbmc, features = c("MS4A1", "CD79A"), ncol = 1) DotPlot(pbmc, features = unique(features)) + RotatedAxis() DoHeatmap(subset(pbmc, downsample = 100), features = features, size = 3)
核心分析：细胞比例变化和差异分析
单细胞的多组对照设计（例如正常组与给药组）可以为细胞类型水平比较提供以往Bulk RNA-seq分析所不能达到的精度。对此一般有两种进阶分析思路：
（1）DE(Differential expression)--两组样本的同一细胞类型的基因表达差异分析； （2）DA(Differential abundance)--两组样本的同一细胞类型的丰度差异分析
参考：http://bioconductor.org/books/release/OSCA/overview.html
这个文章《Single-cell landscape of immunological responses in patients with COVID-19》的figures2和figures3就分别对应细胞比例差异分析和基因表达量差异分析。
各个亚群细分
首先是NK,CD4和CD8细分
第二层次降维聚类分群是：
6 subtypes of CD4+ T cells (CD3E+CD4+), 3 subtypes of CD8+ T cells (CD3E+CD8A+) 3 subtypes of NKT cells (CD3E+CD4–CD8A–TYROBP+).
如上图所示，出现了第三层次降维聚类分群：
naive CD4+ (CD4+ naive) T cell (CCR7+SELL+) memory CD4+ (CD4+ memory) T cell (S100A4+GPR183+) effector memory CD4+ (CD4+ effector memory) T cell (S100A4+GPR183+GZMA+) regulatory T (Treg) cell (FOXP3+IL2RA+) naive CD8+ (CD8+ naive) T cell subset (CCR7+SELL+) effector CD8+ T cell subsets (CD8+ effector-GZMK and CD8+ effector-GNLY), naive NKT (NKT naive) cells (CCR7+SELL+), CD56+ NKT (NKT CD56) cells CD160+ NKT (NKT CD160) cells
有了这些细分的生物学功能亚群，然后又可以进行核心分析：细胞比例变化和差异分析
单细胞的多组对照设计（例如正常组与给药组）可以为细胞类型水平比较提供以往Bulk RNA-seq分析所不能达到的精度。对此一般有两种进阶分析思路：
（1）DE(Differential expression)--两组样本的同一细胞类型的基因表达差异分析； （2）DA(Differential abundance)--两组样本的同一细胞类型的丰度差异分析
参考：http://bioconductor.org/books/release/OSCA/overview.html
划重点：B细胞的细分亚群
如下所示：
主要是6大亚群：
one naive B subset (MS4A1+IGHD+) one memory B subset (MS4A1+CD27+) one intermediate transi- tion memory B subset (intermediate memory B; IGHD+CD27+) one germinal center B subset (MS4A1+NEIL1+) two plasma subsets plasma B (MZB1+CD38+) dividing plasma B (MZB1+ CD38+MKI67+).
当然了，每个亚群各自特异性基因表达量也可视化成功。
更有意思的是，在群里跟大家交流后，提问的小伙伴居然恍然大悟，原来是他自己本来就是看过这个文献。但最开始仅仅是在朋友圈浏览了中文介绍，自己也是下载了原文pdf也是匆匆一瞥。
问题在于
没有记录笔记，其实这样的文献对我们的价值并不大，我们能用到的就是降维聚类分群和各个细分亚群标记基因啊！整理起来也非常容易，但是做过就是做过，比匆匆一瞥好太多了。
写在文末
咱们现在这个专栏《100个单细胞转录组数据降维聚类分群图表复现》分享的代码是到此为止，但是一般来说单细胞文章数据分析还有很多进阶图表制作，比如inferCNV看肿瘤拷贝数变异，monocle看拟时序等等。如果你也需要，可以加入我们这个专栏《100个单细胞转录组数据降维聚类分群图表复现》创作团队，获取进阶指引哦！见：急！计划招募100个单细胞爱好者，免费学全套单细胞降维聚类分群和生物学亚群注释