科研 | Front. Microbiol: 黄土高原某铜尾矿的季节性微生物群落特征及其驱动因素
编译：橙，编辑：小菌菌、江舜尧。
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为了研究在铜尾矿恢复的生态过程中影响土壤微生物的关键环境因素，作者对我国黄土高原的一个铜尾矿土壤的细菌和真菌群落进行高通量测序，并研究了土壤微生物群落组成和功能的季节差异。
结果表明细菌和真菌群落结构存在明显的季节差异。在夏季，细菌群落丰度和真菌群落的Shannon指数最高。土壤亚硝态氮是影响细菌和真菌群落的主导因子。在春季，细菌群落组成主要受到亚硝态氮和铵态氮的影响；在秋季，土壤含水量对真菌群落结构影响显著。此外，真菌群落在季节间表现出显著的功能差异，而细菌群落功能群相类似。
本研究旨在阐明不同生态修复方法下的微生物群落在矿区生态恢复中的响应机制，并进一步明确定殖于土壤生态系统的微生物群落的自然生物肥力特征。
论文ID
原名：Seasonal Microbial Community Characteristic and Its Driving Factors in a Copper Tailings Dam in the Chinese Loess Plateau
译名：黄土高原某铜尾矿库季节性微生物群落特征及其驱动因素
期刊：Frontiers in Microbiology
IF：4.23
发表时间：2020.6
通讯作者：贾彤
作者单位：黄土高原生态恢复山西省重点实验室
研究背景
土壤微生物在维持土壤结构、有机质分解、地球化学循环以及养分供应等方面十分重要，同时对于土壤地球化学碳循环和植物生产力十分重要。其中土壤细菌群落组成和多样性与土壤有机碳转化过程相关，而真菌是有机物和矿物成分分解的重要参与者。因此，土壤微生物群落的任何变化都会导致各种生态过程的变化，例如在矿区退化生态系统中，微生物对于该生态系统的稳定性以及生态恢复的效率起着至关重要的作用。
在受损的有色金属矿山生态系统中，大量重金属与矿区及周边地区的废石、尾矿等矿物粉尘一同直接进入土壤，成为环境污染的主要来源，尾矿的大量堆积导致了严重的污染和当地生态环境的退化。因此，需要对铜尾矿坝进行合理、高效的生态修复，而土壤的生态功能恢复是恢复以及陆地生态系统可持续发展的关键。
在一年的时间中，土壤微生物面临着季节性环境因素的变化，包括温度和湿度水平和以及养分可利用性。因此，土壤微生物往往具有动态的季节变化特征。土壤微生物的生物量和群落结构的季节变化在不同的生态系统中也存在显着差异，因为环境因素的优势程度和与各种环境因素相关的综合效应的复杂程度往往因环境不同而不同。因此，生态恢复过程需压迫关注土壤微生物群落的全年动态变化特征。
本研究旨在明确铜尾矿坝生态恢复过程中影响土壤微生物群落的关键环境因子以及在矿区生态恢复过程中各个季节的有效生物学指标。主要科学问题包括：
(1)土壤细菌和真菌群落随季节变化如何变化？
(2)铜尾矿中具有特殊功能的细菌和真菌是什么？
(3)在一年中，影响土壤微生物结构和多样性的主要环境因素是什么？通过研究这些科学问题，从而为研究不同季节土壤生态系统恢复和退化的机理提供生态学依据，从而加深对污染环境中土壤性质和微生物群落生物多样性恢复的认识。
本研究区域位于中国山西省南部地区的18条河流尾矿(图1)。目前，这个铜尾矿坝由十六个子坝组成。土样采样地点位于536号子坝，并于春夏秋冬四个季节进行了土壤样品采集。并测定土壤样品的总碳(TC)、总氮(TN)和总硫(TS)，土壤含水率，土壤pH，以及铵态氮(NH4+-N)、硝态氮(NO3--N)和亚硝酸态氮(NO2--N)等基础理化性质。并从铜尾矿库四季的土壤样本中进行DNA提取，同时利用MiSeq平台对16S/ITS rRNA基因进行高通量测序。
图1：研究区域全景图（A）铜尾矿坝子坝（B）
结果
1 微生物群落组成及多样性特征
共获得504,999和608,880个高质量的16S/ITS rRNA基因序列，平均长度分别为396bp和266bp。基于97%的序列相似性，得到2982个细菌OTU和810个真菌OTU，这表明测序数据反映了该地区大多数微生物的多样性。在所有样品中，细菌OTUS代表32门79纲171目317科5629属；真菌OTUS包括6门25纲65目138科250属。作者比较了不同季节细菌和真菌群落丰富度值(Chao1和ACE)和多样性指数(Shannon和Simpson)。丰富度值表明，夏季细菌群落丰富度显着高于冬季。Shannon指数表明，真菌群落夏季高于秋季。另外，辛普森指数表明，夏季真菌群落多样性显著高于其他季节，而细菌群落多样性在四季间差异不显著。
2 不同季节细菌和真菌群落的比较
细菌和真菌群落组成的优势种在季节间基本一致，但相对丰度存在差异。在门水平Proteobacteria、Acidobacteria、Actinobacteria和Chloroflexi是相对丰度最高的细菌门(图2A)。Ascomycota和Basidiomycota是优势真菌门(图2B)。在目水平上，优势细菌和真菌群落成员分别是Rhizobiales和Pleosporales(图2C、D)。
图2：不同季节土壤中细菌(A，C)和真菌(B，D)群落的优势门(A，B)和目(C，D)的相对丰度(平均相对丰度>2%)。
基于NMDS和ANOSIM的Bray-Curtis相异度被用来揭示不同季节微生物群落的差异(图3)。ANOSIM显示不同季节细菌和真菌的群落结构均有显著差异(图3)，细菌群落结构和真菌群落结构均有显著差异。此外，线性回归分析显示，真菌群落组成与细菌群落组成呈显著正相关(图4)。
图3：基于细菌(A)和真菌(B)群落组成的Bray-Curtis相似性的非度量多维尺度(NMDS)排序表明季节对细菌和真菌群落结构有显著影响。
图4：不同季节尺度下土壤真菌与土壤细菌群落Bray-Curtis距离的关系
在科水平，前10个优势微生物如图5所示。对于细菌群落，作者在科水平上观察到norank_c_Acidobacteria和Hyphomicrobiaceae存在显著差异(图5A)。对于真菌群落，作者在科水平上观察到Teratosphaeriaceae和unclassified_c_Leotiomycetes在四季都有显著差异(图5B)。
PICRUST和FUNGuild功能预测结果表明，细菌和真菌在铜尾矿坝中扮演重要角色(图6)。细菌在不同季节表现出相似的功能特征(图6A)。这些功能特征主要包括与能量产生和转换过程、氨基酸运输和代谢过程、碳水化合物运输和代谢过程、转录过程以及与细胞壁、膜和被膜机制相关的生物发生和信号转导过程相关的功能(图6A)。然而，我们观察到四季之间真菌功能的显著差异。秋季检出的土壤真菌OTU中，植物病原菌占49.8%(图6B)。春季动物病原菌、地衣内生真菌、植物病原菌、腐生真菌的相对丰度均显著高于其他3个季节，寄生真菌的相对丰度在秋季最高(图6B)。兰花菌根仅在夏季观察到，外生菌根则主要发生在冬季和春季(图6B)。
图5：前10个细菌(A)和真菌(B)科的相对丰度在季节之间存在显著差异。
图6：PICRUSt和FunGuild预测细菌(A)和真菌(B)的功能变化。
3 微生物群落结构与环境变量的相关性
土壤理化特性随季节变化。土壤养分(TN和TC)在夏季显著高于其他季节，pH以冬季最高。亚硝态氮在秋季显著高于春季和夏季。秋季土壤含水量(SWC)显著低于其他季节。该评估了这些理化因素对不同季节微生物群落结构的影响(图7)。结果发现，36.95%的细菌变异可以用土壤性质来解释(图7A)。RDA图的轴1解释了大约30.64%的变异，轴2进一步解释了6.31%的变异。结果表明，铵态氮、硝态氮、亚硝态氮和TN是细菌群落结构的主要控制因子(图7A)。土壤性质可以解释真菌群落结构变异的27.9%(图7B)，其中轴1解释了15.21%的变异，轴2进一步解释了12.69%的变异。剔除冗余变量后，选取4个土壤性状进行CCA分析。如图7所示，土壤含水量、土壤温度(ST)、亚硝态氮和pH对真菌群落结构有显著影响(图7B)。
图7：细菌（A）及真菌（B）微生物群落结构与环境变量的关系
相关热图(图8)进一步研究了微生物与环境之间的关系。Alphaproteobacteria和Betaproteobacteria与土壤C/N呈正相关,与SWC呈负相关（图8A)。据报道，Proteobacteria在金属污染的土壤中耐受性最强。Acidobacteria与土壤TC、TN、和C/N呈显著正相关（图8A）。Acidobacteria能够降解复杂的纤维素和木质素从而提供土壤养分。在真菌群落中，Agaricomycetes和Lecanoromycetes与SWC、盐分和电导率呈显著负相关(图8B)。Agaricomycetes 作为重要的分解者，同时产生过氧化氢和多种酶类，能够降解复杂的植物化合物，如纤维素和木质素。土壤真菌具有较强的分解能力，对于不稳定的有机碳的影响主要取决于分解有机物特别是顽固性有机物的各种酶。作者还发现，在所有四个季节中，Basidiomycota和Ascomycota都是主要的真菌门。这两个真菌门具有关键基因，可以编码纤维素分解酶并促进碳转化过程。
图8：斯皮尔曼相关行表明细菌（A）和真菌（B）与理化因子的关系
作者通过构建SEM结构方程模型，进一步量化了驱动因素对微生物群落的贡献(图9)。土壤亚硝态氮是影响细菌和真菌群落的主导因子。此外，硝态氮和铵态氮之间的相互作用是直接和显著的，但在土壤中没有观察到细菌和群落的相互作用(图9)。
图9：结构方程模型（SEM）说明了土壤性质对微生物群落的影响。连续箭头和虚线箭头分别表示重要关系和非重要关系。在与箭头相同的方向上标记的相邻数字表示路径系数，箭头的宽度与路径系数的大小成比例。绿色和红色箭头分别表示正向和负向关系。
讨论
1 铜尾矿坝土壤微生物多样性研究
土壤生态功能是以土壤微生物群落为基础的。土壤微生物影响土壤养分循环和调节，它们可以通过参与土壤有机质的相关分解和矿化过程而被用作土壤功能的指示器。在该研究中，细菌丰富度、真菌丰富度和Shannon指数在夏季达到最大值，表明这个特定季节的土壤微生物总体活性最高。这可能是因为植物光合作用在夏季很强。换句话说，光合产物通过根系进入土壤，这些产物被微生物用作营养源，从而促进微生物的生长和繁殖。另一种可能的解释是，季节变化也会影响微生物的生长。该研究调查的铜尾矿区夏暖冬冷。一般来说，微生物活性和物种丰富度随着温度的升高而增加，而微生物活性随着温度的降低而下降。这可能是因为微生物膜的脂质流动性降低，导致细胞内液体冻结以及细胞破裂和死亡。因此，夏季的高温为土壤微生物的生长提供了相对稳定的环境。
2 土壤微生物群落组成及其功能
铜尾矿的优势菌为Proteobacteria、Acidobacteria、Actinobacteria和Chloroflexi。研究发现，季节变化对铜尾矿土壤中的优势细菌有显著影响。Bacteroidetes的相对丰度低于Acidobacteria，Bacteroidetes的相对丰度在冬季最高。Margesin和Schinner(1994)报道，Bacteroidetes是一种耐寒细菌，具有独特的抵抗低温的生理机制，这使得这个门的成员能够在寒冷的环境中生存。Acidobacteria是一种寡营养细菌门，而Bacteroidetes则具有熵特征。这项研究的结果也可能是由于铜尾矿坝土壤养分枯竭造成的，土壤氮成为研究区域的限制因素。
Ascomycota和Basidiomycota是优势真菌门。它们是土壤中的主要分解者，同时也对土壤细菌(A)和真菌(B)群落结构起着至关重要的作用。真菌群落表现出明显的季节变化特征，这表明环境条件的季节性变化导致微生物群落表现出季节性变化。铜尾矿坝中Basidiomycota的相对丰度在夏季最高，这是因为从根到土壤的能量促进了植物的生长，随后在夏季根区周围的菌根真菌也发生了变化。大多数担子菌门可以与根形成菌根，而只有少数子囊菌门成员可以形成菌根。此外，大多数Basidiomycota都是腐生植物。在本研究中，Basidiomycota的相对丰度在四季都很高。Basidiomycota对环境胁迫的反应相对稳定，因为它是多污染和非污染生态系统中的优势门，Basidiomycota对环境胁迫的反应是相对稳定的，因为它是多污染和非污染生态系统中的优势门。
真菌群落的功能特征在四季间表现出明显的差异，而细菌功能群则没有明显的差异。土壤细菌和土壤真菌群落功能的季节响应差异可能是由于真菌对各种环境变化的敏感性较低所致。这是因为真菌的生成通常比细菌的生成慢，因此对土壤干扰的反应更慢。腐生真菌的丰度随着温度的升高而增加，而外生菌根真菌的丰度一般随着温度的升高而降低。研究还表明，腐生真菌在夏季丰度较高，而共生真菌在冬季丰度较高。温度上升导致微生物丰度增加，并伴随着有机物在夏季的分解。腐生真菌在有机质分解中的作用尤为重要。功能性真菌群之间存在竞争，病原和腐生土壤真菌在整个非生长季节和生长季节都与根系紧密结合。外生菌根真菌逐渐取代其他真菌类群，最终成为生长季节的优势真菌群落。
3 土壤微生物群落与土壤因子的关系
土壤速效氮含量显著影响细菌群落结构，是土壤细菌群落季节变化的主导因子。这表明细菌群落对土壤养分有效性的适应性不同，从而导致细菌群落的季节性变化。土壤养分的增加会促进微生物的生长，微生物丰度在一定程度上代表了土壤生物肥力的好坏。而土壤pH通过影响土壤理化性质和土壤基质组成来影响土壤微生物生物活性。在研究中发现Phycisphaerae和Cyanobacteria与pH呈正相关。众所周知，Cyanobacteria可以在植物根上定居，这可以促进植物生长。同时，Cyanobacteria由于其固氮能力，是植物无机氮的主要来源。Alphaproteobacteria和Betaproteobacteria与土壤C/N呈正相关，与SWC呈显著负相关。据报道，Proteobacteria是在严重土壤污染条件下最耐受环境压力胁迫的门。此外，Proteobacteria在形态、生理和代谢过程中表现出相当大的多样性，这表明这种细菌可以通过生理和代谢调节过程来适应不同的环境。我们还发现，Acidobacteria与土壤TC、TN和C/N呈正相关，Acidobacteria可以降解复合木质素和纤维素来提供土壤养分。
在未来的研究中，Cyanobacteria、Proteobacteria、Acidobacteria、Basidiomycota和Ascomycota可在生物修复过程中直接接种到植物或土壤中，并研究它们对植物生长和生理的影响，以便通过微生物和植物的联合作用更好地修复被污染的土壤。通过对铜尾矿季节性微生物群落的联合调查为进一步阐明矿区生态恢复下的微生物响应机制提供了新的出发点，能够更好地了解微生物群落通过自然生物肥力来定殖土壤生态系统的能力。此外，铜尾矿坝污染土壤中自发性降解菌的响应机制还有待进一步研究这些物种的抗逆性和耐受性，以及参与这些生物降解菌响应过程的分子机制。