科研 | Environmental science: Nano: 土壤酶活性和细菌群落对黑磷纳米片的响应（国人作品）
编译：艾奥里亚，编辑：小菌菌、江舜尧。
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目前，黑磷（BP）被广泛应用于各个领域。考虑到BP纳米片对哺乳动物细胞和细菌具有潜在毒性，因此有必要对其所产生的生态效应进行评价。
本研究以东北黑土和棕壤作为研究对象，探究了BP纳米片对土壤酶活性、土壤细菌群落结构和功能的影响。我们发现在BP纳米片处理60天期间，其对黑土酶活性没有显著影响。相反，BP纳米片对棕壤土壤脲酶和土壤过氧化氢酶活性分别在第10天和第30天表现出显著的抑制效果，但在第60天得到恢复。BP纳米片的引入显著降低了棕壤在第10天时的群落丰富度，但对黑土的多样性和丰富度没有影响。这可能是由于BP纳米片与富含有机质的黑土之间存在较强的相互作用，导致BP纳米片的生物利用度降低。
通过功能预测，我们发现，BP纳米片对两种土壤中细菌功能的影响可以忽略不计。在进一步的研究中，有必要深入地探究BP纳米片的作用机理和剂量依赖效应，从而为BP纳米片的安全使用和排放奠定基础。
论文ID
原名：Response of soil enzyme activity andbacterial community to black phosphorus nanosheets
译名：土壤酶活性和细菌群落对黑磷纳米片的响应
期刊：Environmental science: Nano
IF：7.704
发表时间：2020.02
通讯作者：赵青，王伟东，邢宝山
作者单位：中国科学院沈阳应用生态研究所，黑龙江八一农垦大学，马萨诸塞大学
实验设计
本研究分别选取东北黑土以及棕壤作为研究对象，其中黑土采自黑龙江省克山农场，棕壤采集自辽宁沈阳农田生态系统国家野外科学观测研究站，具体理化参数如表1所示。所有土壤样本在实验前手动去除植物根系以及大颗粒土壤，过2 mm筛备用。实验前先将土壤置于培养箱中培养一周，随后2 kg土壤样本置于烧杯中，添加不同浓度BP纳米片（10，50 mg/kg），培养周期60 d，每周通过补充无菌水以维持土壤保持田间持水力。相同体积的无菌水作为对照培养。在培养期间，分别在0，10，30 d以及培养结束时（60 d）采集土壤样本，一部分用于测定土壤理化参数，另一部分用于测定土壤微生物多样性。
表1 本研究土壤样本的主要理化参数。
结果
1 BP纳米片对土壤酶活的影响
本研究测定了黑土以及棕壤在BP处理不同时间下，土壤脲酶、过氧化氢酶和磷酸酶活性的变化情况。在整个60天的实验期间，BP纳米片对黑土土壤酶活性没有显著的影响（图1a，c，e）。相反，BP纳米片对棕壤中的土壤脲酶和过氧化氢酶活性表现出显著性影响，但对中性磷酸酶活性无显著影响（图1b，d，f）。10和50mg kg-1浓度的BP处理下，棕壤10d时土壤脲酶活性分别下降17.05%和23.26%（P < 0.05），但在60 d时完全恢复（图1b）。而50 mg kg-1浓度的BP处理下，棕壤土壤过氧化氢酶在10 d时提高了15.52%（P < 0.05），在30 d时急剧下降，但随后恢复，在60 d时分别恢复到对照组的81.46%和85.37%（10 mg kg-1和50mg kg-1）。已有研究发现，BP纳米片可以提高细菌细胞内的活性氧（ROS）水平，这可能对土壤细菌产生负面影响，从而抑制脲酶活性。由于过氧化氢酶被认为是抵御活性氧的主要指标之一，为了消除土壤环境中过量的活性氧，过氧化氢酶活性在第10天得到增强，这与其他研究相一致。然而，为了保持棕壤的微生物量，土壤过氧化氢酶负担过重，所以在BP剂量为10和50 mg kg-1时，过氧化氢酶的活性在第30天分别下降到初始水平的24.14%和20.69%（图1D）。有趣的是，在60d时，试验组的脲酶和磷酸酶活性均与对照组相当，表明BP纳米片对棕壤中的酶活性的影响狮子暂时性的。一方面，BP在环境条件下随着时间的推移而降解，另一方面归因于BP暴露期间细菌功能的自我调节作用。土壤的理化性质，包括质地、有机质、pH等都会影响纳米颗粒对土壤土酶活性的影响。本研究中，与黑土相比，棕壤中土壤酶活性对BP纳米片更为敏感。此外，我们研究发现，BP纳米片与黑土之间的相互作用强于棕壤，因此我们认为，黑土中有机质含量较高（表1），降低了BP纳米片在黑土中的生物有效性。
2 土壤细菌丰度
60天培养周期内，BP处理下，两种土壤中在基因拷贝数方面没有显著差异（表2），表明暴露BP纳米片对土壤细菌生物量的影响有限。基于高通量测序，我们在门水平和属水平上对BP处理下的土壤细菌相对丰度水平进行了分析，以探究BP对土壤细菌的影响。门水平上Actinobacteria，Proteobacteria，Acidobacteria，Chloroflexi，Gemmatimonadetes，Nitrospira以及Planctomycetes为主要优势细菌门，其丰度之和在两种土壤中均占细菌总数的85%以上（图2a和b），其中大多数细菌门对BP纳米片均不敏感。目前已有研究发现，酸性pH有利于促进Acidobacteria在实验室培养条件和土壤环境中的生长，本研究中，BP暴露过程中导致了土壤pH的降低，因此在培养60天后，Acidobacteria的相对丰度略有增加，从7.61±0.71%增加到11.35±1.34%（P < 0.05）。此外，在黑土中，在培养10 d时Actinobacteria的相对丰度显著高于对照。有研究发现，磷酸酶编码基因（Pho D）主要存在于Actinobacteria中，因此，随着BP纳米片的降解可能会刺激Actinobacteria的生长。然而，这种促进生长的作用在第60天就消失了（图2c）。对于棕壤来说，BP纳米片暴露60d后，Bacteroidetes的相对丰度从1.62± 0.26%轻微增加到2.25 ± 0.29%（P < 0.05）（图2d）。此外，BP纳米片抑制了Latescibacteria的生长，其相对丰度从1.17±0.06%降至0.95±0.10%（P<0.05）（图2d）。与黑土不同，棕壤中的Acidobacteria的丰度没有明显变化。这可能归功于，在BP暴露期间，棕壤土壤pH值相对保持恒定，不足以对Acidobacteria的生长造成影响。
在属水平上，BP纳米片对大多数细菌的相对丰度的影响也为表现出显著性影响。在第60天，BP处理的样品中Pseudomonas在两种土壤中的相对丰度均高于对照（图3c和d）。Acidobacteria门中最丰富的细菌属RB41，在黑土中，在BP处理60 d下，其丰度（3.37±1.07%）比对照（1.72±0.21%）略有增加（图3c），这有助于提高Acidobacteria的丰度（图2c）。相比之下，棕壤中RB41的相对丰度与对照没有显著差异，说明不同土壤类型的RB41对BP纳米片的敏感性不同。一些磷代谢细菌，如Gemmatimonas和Bacillus，在不同的土壤类型中对BP纳米片表现出不同的反应（图3c和d）。例如，BP纳米片促进了Bacillus在棕壤中的生长，但在60天时抑制了它在黑土中的生长。但有关微生物在更深入机理方面还需从细菌代谢和抗逆性两个方面进行深入研究。
3 细菌多样性和群落结构
基于高通量测序，我们在30个土壤样品共获得1,174,366个序列，在97%的相似性水平上可划分为377,188个OTUs。基于微生物丰富度和多样性分析结果表明，在整个培养过程中，BP纳米片对黑土的细菌丰富度和多样性没有影响（图4a-c，P > 0.05），但在棕壤培养10天时，细菌丰富度显著下降了16.60%（按Chao 1指数计算）（图4d-e，P < 0.05）。这一结果表明，BP纳米片在棕壤的早期（第10天）可能会对细菌群落产生负面影响。然而，培养60 d后，BP处理的样品与对照的细菌丰富度没有差异。基于Shannon指数，细菌多样性在0 d到60 d之间有所下降，对照和BP处理的细菌多样性分别下降了2.60%和1.44%（图4f），表明BP处理对细菌群落的动态影响较小。
利用主成分分析（PCA）和非加权配对平均法（UPGMA）我们探究了细菌群落结构对BP纳米片处理的响应。结果表明，相对于黑土细菌群落结构，棕壤细菌群落结构对BP更加敏感。具体地说，BP处理的黑土样品大部分分布接近对照，在60d内没有明显的聚集趋势。相比之下，BP处理的棕壤样品在第60天更容易相互聚集并与对照分离。这一结果与PCA结果相一致。
4 BP纳米片对细菌功能影响的预测
基于我们观察到对酶活性（图1）和细菌群落（图2-4）的微不足道或是存在短期的影响，因此我们采用一种更微妙的技术来探索BP纳米片潜在的生态风险。有研究发现，微生物功能性状是轻度干扰下的敏感指标，虽然PICRUST不能确定实际功能，但它可以将16S rRNA测序数据转化为预测的宏基因组，用于预测微生物群落的功能变化。在黑土和棕壤样品中，功能预测计算出的NSTI值都小于0.23，这确保了功能预测的可靠性和准确性。在KEGG level2中，大多数途径与代谢有关（近似于52%），随后是环境信息处理（约16%）和遗传信息处理（约15%）。与对照组相比，BP纳米片处理后两种土壤中KEGG途径通路无显著差异（图5）。基于PICRUST功能预测，有研究发现，Ag纳米颗粒对氨基酸代谢，碳水化合物转运和代谢以及信号转导机制会产生负面影响，与此相似，CuO纳米颗粒对膜运输、翻译和代谢相关的途径也会造成负面影响，这主要是由于纳米材料的纳米尺度效应，而非金属离子的离子效应。与这些纳米颗粒相比，BP纳米片更加环保，从而为大规模生产和应用提供了可能性。
图5 基于Kyoto Encyclopedia ofGenes and Genomes（KEGG）数据库，黑土（a-b）和棕壤（c-d）中不同KEGG代谢途径在第10天（a，c）和60天（b，d）的相对丰度。误差线代表重复之间的标注差（n=3）。
总结
本研究中，我们通过评估BP暴露对黑土和棕壤的土壤酶活性、细菌群落和细菌功能的变化来研究BP纳米片的生态效应。与棕壤相比，黑土酶活性和细菌群落结构对BP纳米片的响应较小。这种差异归因于BP纳米片与富含有机质的黑土之间较强的相互作用，导致降低了BP纳米片在黑土中的生物利用度。然而，基于功能预测发现，BP纳米片对两种土壤中细菌群落功能的影响可以忽略不计。总体而言，BP纳米片比许多其他纳米材料表现出更加生态友好的特性。本研究初步了解了BP纳米片对土壤环境的影响。在今后的研究中，BP纳米片在不同环境条件下的生态毒理学研究，如土壤质地（沙土、壤土、粘土）、含水量、人为干扰（化肥）等，以及其内在的毒性机制还需要进一步的进行研究。
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