引物合成的基本原理

目前引物合成基本采用固相亚磷酰胺三酯法。基于该方法的DNA合成仪有多种，主要差别在于合成产率的高低，试剂消耗量的不同和单个循环用时的多少。通用生物公司采用新一代高通量自动基因合成仪技术，充分保证了实验室相关领域的研究及生物产业应用的不同需求。

固相亚磷酰胺三酯法合成DNA片段，具有高效、快速偶联以及起始反应物比较稳定的特点。该方法是在固相载体上完成DNA链的合成的，合成方向是由3’端开始，相邻的核苷酸通过3’→5’磷酸二酯键连接。具体的反应步骤如下：

第一步，脱保护基(Deblocking)，将被固相载体（CPG，树脂等）上保护的活性基团与三氯乙酸反应，脱去其5'-羟基的保护基团DMT，获得游离的5'-羟基；

第二步，活化(Activation)，将亚磷酰胺保护的核苷酸单体与四氮唑活化剂混合并进入合成柱，形成亚磷酰胺四唑活性中间体(其3'-端已被活化，但5'-端仍受DMT保护)，此中间体将与GPG上的已脱保护基的核苷酸发生缩合反应；

第三步，连接(Coupling)，亚磷酰胺四唑活性中间体遇到CPG上已脱保护基的核苷酸时，将与其5'-羟基发生亲合反应，缩合并脱去四唑，此时合成的寡核苷酸链向前延长一个碱基；

第四步，带帽(Capping)，缩合反应后，为了防止连在CPG上的未参与反应的5'-羟基在随后的循环反应中被延伸，常通过乙酰化来封闭此端羟基，一般乙酰化试剂是用乙酸酐和N-甲基咪唑等混合形成的；

第五步，氧化(Oxidation)，缩合反应时核苷酸单体是通过亚磷酯键与连在CPG上的寡核苷酸连接，而亚磷酯键不稳定，易被酸、碱水解，此时常用碘的四氢呋喃溶液将亚磷酰转化为磷酸三酯，得到稳定的寡核苷酸。

经过以上五个步骤，一个脱氧核苷酸被连接到固相载体的核苷酸上。再以三氯乙酸脱去它的5'-羟基上的保护基团DMT，重复以上步骤，直到所有要求合成的碱基被接上去。合成过程中可以观察TCA处理阶段的颜色判定合成效率。