m6A-seq 数据处理及图表复现交流群
但很多粉丝留言表示这些英文教程看不懂,数据也很分散,没有中文解说实在是很难跟下来,希望我们出一个手把手系列教程。
这个全套 MeRIP-seq 图表复现代码在GitHub:https://github.com/al-mcintyre/merip_reanalysis_scripts 这个也是接近2G的压缩包!
其实很早以前我就在《生信技能树》发布过教程:新的ngs流程该如何学习(以CUT&Tag 数据处理为例子),提到了我自己是不太可能去把所有的ngs流程全部录制视频的,只能说是更好的传达学习方法给到大家。其实如果你看过我表观组学,比如《ChIP-seq数据分析》 和 《ATAC-seq数据分析》 就会发现其实这个m6A数据处理大同小异的,当然了,肯定是会有一些细微差异是需要注意的。
虽然我没有时间,但是我们的两次求贤令:曾经我给你带来了十万用户,但现在祝你倒闭,以及 生信技能树知识整理实习生招募,还是有幸招募到了愿意花时间给大家做整理的小伙伴。所以有了这个MeRIP-seq 图表复现交流群。
01-文献解读|在人的四种不同组织中m6A甲基化的遗传驱动因素
1.文献信息
标题:Genetic drivers of m6A methylation in human brain, lung, heart and muscle
发表时间:2021年7月1日
杂志:Nature Genetics(2020IF=27.605)
作者:麻省理工学院计算机与人工智能实验室Manolis Kellis课题组
数据和方法
主要数据
可以看到,样本量还是蛮可观的!
m6A meRIP–seq across human tissues
文章主要使用的链特异性建库和双端45bp的测序策略,第一次遇到测这么短的啊:
We used the SMARTer Stranded RNA-Seq Kit from Clontech/Takada, which is optimized to work with 100pg of starting material. The libraries were sent for 2×45-base-pair paired-end sequencing.
甲基化数据提到的数据库为eGTEx,可以参考:https://cloud.tencent.com/developer/news/397979 进行此数据库的了解。
分析流程:
1.去除tRNA和rNRA:使用bowtie2将read比对到tRNA和rRNA,保留 the unmapped reads tRNA:downloaded from the University of California, Santa Cruz Table Browser rRNA:downloaded from the National Center for Biotechnology Information Nucleotide database 2.比对到参考基因组:使用hisat2 比对到the hg38 human genome:GENCODE (v26; downloaded from https://gtexportal.org/home/datasets Peak calling:MACS2
我们后续就按照这个流程来进行图表复现!
主要结果
这是一篇研究quantitative trait loci(QTL)与m6A修饰关联的文章,我们这次主要关注m6A的地方,即结果1。
结果1:m6A variation across tissues and individuals
107个病人共176个样本,在QC之后,剩余91个病人129个样本做分析:53 brain, 12 heart, 32 muscle
and 32 lung samples,见下图A。
Peak calling共得到>278,000个peak位点(每个位点至少在两个病人中存在),平均每个样本约20,000个位点。
这些Peaks中,与以前的结果相比,有很多都是以前未检测到的peak。比较的对象是来自数据库RMBase v2.0中发表的peaks。
RMBase v2.0: deciphering the map of RNA modifcations from epitranscriptome sequencing data
并且,检测到的Peaks位点的主要集中在终止密码子附近。
作者还将以前没有检测到的m6A位点序列特征分布也绘制了一个图,如下,这个图5’UTR位置的信息要比终止密码子的信号值高:
保守序列特征:GGACH
利用m6A谱对样本进行相似性分析,发现组织类型是主要的差异来源,与基于RNA表达谱的样本相似性分析结果类似。
基于m6A谱的样本相似性聚类:
基于RNA表达谱的样本相似性聚类:
具有组织特异m6A修饰位点的基因的功能富集结果显示,组织功能相关功能富集:
此外,作者还对具有组织特异性m6A修饰位点的基因进行了展示:
这些具有m6A修饰位点信息的基因可以在数据库进行查询展示:https://www.gtexportal.org/home/browseEqtls?location=chr1%3A750000-850,000
大脑特异m6A修饰的POU3F2基因:
肺特异的m6A修饰EGFR 基因
最后,不同组织总都有m6A修饰的基因在不同组织中的表达不差异,具有m6A修饰组织特异的表达 也特异。这表明m6A可以导致其他广泛表达的转录本的组织特异性功能。
其他内容结果如下,详细版本可以前往看文献:
结果2:m6A genetic driver discovery and validation
结果3:Tissue specificity of m6A QTLs.
结果4:m6A QTLs and eQTLs sometimes overlap but are mostly independent
结果5:m6A QTLs help interpret GWAS loci
结果6:Tissue-specific m6A-QTL enrichments of GWAS variants
结果7:Novel m6A regulator prediction
非常好的资源:
此篇文章贡献了作者全部的分析代码,如下:
下载链接
http://compbio.mit.edu/m6AQTLs/
可惜的是下载不到数据啊,即使是m6A的bed文件也没有公开,只能在GTEx中进行相关位点信息查询。
如有万能的网友能搞到数据,我就可以给你复现整个文章了。
不过,我还有plan B:准备找一套其他的数据,利用此篇文献的所有代码进行数据分析。后续即将更新~
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