​Nature Portfolio | 研究癌症，从单个细胞开始

肿瘤看似是独立的对象，但其实每一个都是细胞的动态集合。不从整体去研究肿瘤，而是对其中众多不同的单个细胞进行分析，有助于深入了解癌症的进程和治疗耐药性背后的机制。

我们对癌症研究的越多，就会发现越多与肿瘤相关的变异。“一个豌豆大小的肿瘤可以有数十个乃至成百上千个克隆和子细胞，每个细胞的基因突变和基因表达都略有不同。”西雅图瑞典癌症研究所的肿瘤学家Kelly Paulson说。

每个细胞都带有各自独特表观遗传标记的DNA，以及独特的RNA转录本和合成的蛋白质。在单细胞水平上研究肿瘤，为了解肿瘤对治疗的反应提供了广阔的视角。

肿瘤内和肿瘤间的癌细胞可能具有不同的细胞形态、基因表达模式、增殖速率、转移潜能和治疗敏感性。这种异质性是理解和治疗癌症的主要障碍。Paulson补充道：“在治疗开始时存在一个或几个耐药细胞克隆的几率很高，这就解释了为什么目前的治疗方法通常会让肿瘤缩小，但很少能治愈，而且只对某些癌症有效。”

传统的分子分析技术通常被称为批量测序，对于识别与癌症相关的常见突变和基因表达模式是有用的，但往往无法识别罕见克隆的亚群。然而，单细胞技术能够分析许多单个细胞的DNA突变和基因表达模式，因此有可能在治疗前或治疗期间识别出耐药细胞。批量测序和单细胞测序就好比水果奶昔和水果沙拉，在放入搅拌机之前确定水果（细胞）的类型和特征显然要容易得多。

技术进步使研究人员能够从成千上万的单个细胞中收集并破译全基因组信息，这为癌症研究开辟了新途径。对细胞DNA（基因组）、调控基因表达的表观遗传标记 （表观基因组）、基因表达的RNA转录本（转录组）和蛋白质表达（蛋白质组）进行高通量的单细胞测序为研究癌症转移和复发提供了新的思路。此外，通过分析来自不同时间和空间的数据，研究人员能够验证有关肿瘤微环境和细胞间相互作用在癌症进展中所扮演角色的新假设，并有可能发现新的治疗靶点。

获得新层面上的信息

“单细胞测序达到了曾经无法实现的数据分辨率。”研究治疗后肿瘤异质性的计算生物学家Ignaty Leshchiner说，他是博德研究所癌症基因组计算分析团队的高级团队负责人。Leshchiner正在开发整合单细胞和批量测序数据的方法。他希望融合肿瘤样本的这两类数据，从而比单独使用其中一种方法更准确地识别疾病相关的基因和信号通路。

Leshchiner表示：“高通量单细胞测序的一个优点是可以对周期性的细胞类型或状态进行多次测量。”这种方法使他能够可靠地描述细胞的亚群。这并不表示批量分析没有价值，它可以用来重建细胞的主要亚群，并确定各类群中检测到的突变[1]，单细胞DNA测序则由于在提取过程中失去了大部分基因组而无法完成这一任务。Leshchiner说：“使用批量和单细胞测序方法能够更好地了解正在发生的情况，并开始研究基因突变对疾病动力学的影响。”

肿瘤细胞及其他

单细胞测序的应用实际上已经超出了肿瘤细胞的范围。越来越多的证据表明，肿瘤内和周围的非恶性细胞在疾病进程中发挥着重要作用。针对肿瘤微环境的研究与以免疫细胞而非癌细胞本身为目标的免疫疗法密切相关。这种增强免疫的策略已经在多种癌症的治疗中获得成效，包括特定类型的淋巴瘤、黑色素瘤、白血病和肺癌。

然而，目前还不清楚为什么大多数免疫疗法只在有限的时间内对某些患者有效。通过研究免疫细胞和癌细胞之间复杂的相互作用，研究人员开始发现这些失败背后的原因。“单细胞RNA测序确实彻底改变了我们对肿瘤微环境以及为什么免疫疗法会失效的理解。”Paulson表示。

患者在接受免疫治疗几个月后经历癌症复发的原因有多个。例如，杀死癌细胞的免疫细胞可能不再活跃或无法浸润肿瘤，或者癌细胞可能找到了逃避它们的方法。Paulson曾和同事使用批量外显子组测序来研究为什么两个转移性皮肤癌患者在接受免疫治疗一年后复发，但他们找不到任何额外的肿瘤相关突变可以解释其对免疫反应的逃避。

研究人员使用高通量的单细胞RNA测序来研究细胞转录组时，发现肿瘤细胞降低了特定基因（HLA A或B）的表达，使细胞对免疫系统“隐身”[2]。该基因编码了一种细胞表面蛋白，这种蛋白可以将目标抗原暴露给免疫细胞。该基因中的突变曾被证明可以通过促进免疫逃避来促进肿瘤生长，但是这些病人的基因并没有发生突变。事实上，该基因的表达下调，产生了与使癌细胞产生耐药性相同的效果，只是没有发生DNA的改变。Paulson的研究通过使用多模式的分析（RNA和DNA），揭示了转录水平的一个新调控机制，并且可能通过药物治疗逆转。

确定发生的顺序

免疫治疗是如何在转录水平上诱发这种反应的？它是可逆的吗？新加坡科技研究局（A * STAR）下属的新加坡基因组研究所癌症研究员Ramanuj DasGupta正在通过研究单个癌细胞在治疗前后的转录组和表观基因组来解答这些问题。

“单细胞RNA测序使我们能够绘制出单个细胞在药物选择性压力下演化的轨迹。”DasGupta说。这些轨迹使他能够确定耐药细胞亚群是否在治疗开始之前就存在，抑或是在治疗后才出现。

他的团队发现在治疗开始前，癌细胞克隆上带有转录调节的染色质标记，这些标记位于与耐药相关的基因上，意味着这些细胞已经准备好进行表观基因重编程并改变基因表达。例如，研究人员发现当这些细胞接触到化疗药物顺氯氨铂后，细胞基因组中以前不可及的区域开始结合转录因子并激活基因表达[3]，从而向耐药性过渡。癌细胞在表观遗传水平上的异质性支持使用针对表观遗传调节因子（如乙酰转移酶抑制剂）的药物来预防或逆转耐药性。

染色质可及性实验的改进，如ATAC-seq（通过测序确定转座酶可及的染色质），意味着研究人员可以在单细胞水平上获得全基因组的基因开关活动模式。将这些信息与基因组和转录组数据相结合，有助于他们理解调控区域基因突变的作用及其对基因表达的影响。

汇集这些信息超出了一个实验室的能力范围。DasGupta希望利用新加坡各地合作项目产生的数据。他说：“我们正在制定一项综合性癌症研究策略，在基因组、表观基因组和转录组水平上结合单细胞测序工作。”他十分期待看到未来五年将产生的大量数据，以及这些数据将会如何增进免疫疗法或标准化疗耐药机制方面的认知。

增加新的维度

单细胞研究中最令科学家兴奋的领域之一是成像技术的发展。成像技术能够同时显示组织切片中数千个基因的表达，被称为空间转录组学。DasGupta说：“通过给单细胞转录组特征增加空间分辨率，我们能够看到细胞在肿瘤内如何相互作用并发挥功能。”例如，在肿瘤周围或被T细胞包围的特定位置发现某些细胞类型或状态，可能为研究这些细胞在转移、T细胞浸润或T细胞衰竭中的作用提供新的线索。

DasGupta表示，这些信息可能导致治疗策略的改变，从突变驱动的策略到影响肿瘤及其微环境的转录组特征的相关策略。单细胞测序方法有助于揭示许多癌症类型中非肿瘤细胞的存在和特征，而空间转录组学可以进一步阐明它们与肿瘤细胞的相互作用如何影响疾病进展。目前已经有许多可能有助于预防疾病进展或复发的候选研究，包括肺癌中与癌症相关的成纤维细胞[4]和保守的髓细胞群[5]，前列腺癌骨转移中的破骨细胞和成骨细胞[6]，以及胰腺导管腺癌耐药性中的胰腺星形细胞[7]。

未来展望

从单细胞中扩增DNA和RNA的方法有所改进，加上测序通量的扩大和成本的下降，使单细胞研究方法对研究人员更具吸引力且更易实现。总部位于圣迭戈的领先测序技术提供商因美纳（Illumina）的单细胞测序行业市场经理Steven Hoffman见证了这一不断增长的需求。他说：“采用这种方法的研究人员急剧增多，他们对灵敏度、数据分析和可视化有着不同的要求。”

在过去的十年中，使用单细胞测序技术的论文数量呈指数级增长。Hoffman解释道：“因美纳的测序技术能够满足客户的不同需求，同时提供最高质量的单碱基读出，这在处理单细胞时是非常重要的。”

然而，将单细胞测序技术产生的大量数据转化为有用的信息仍然是一个重要的挑战。Hoffman说，能够确保结果准确性和可重复性的生物信息学新方法将有助于解读数据，帮助单细胞测序技术走出研发领域，走向临床。“随着单细胞测序方法被应用于临床样本，并被纳入大规模临床试验，我们希望它们能在不远的将来为治疗决策提供信息。”

参考文献：

1. Parikh, A.R. et al. Nat Med 25(9),1415–1421 (2019)

2. Paulson, K., et al. Nat Commun 9, 3868 (2018)

3. Sharma, A., et al. Nat Commun 9,4931 (2018)

4. Waise, S., et al. Cancer Res 79 abstr. 3762 (2019)

5. Zilionis, R., et al. Immunity 50(5), 1317–1334 (2019)

6. Park, S.H., et al. Calcif Tissue Int 102(2):152–162 (2018)

7. Thomas, D. & Radhakrishnan,P. Mol Cancer 18: 14 (2019)

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