13种人体组织的单细胞RNA测序鉴定人类冠状病毒感染的细胞类型和受体
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摘要
从2019年12月开始，中国湖北武汉爆发了新的冠状病毒（SARS-CoV-2），已宣布为全球性公共卫生突发事件。血管紧张素I转换酶2（ACE2）是SARS-CoV-2感染人体细胞的宿主受体。尽管据报道ACE2在肺，肝，胃，回肠，肾脏和结肠中表达，但其表达水平却很低，尤其是在肺中。SARS-CoV-2可以使用共受体/辅助蛋白作为ACE2伴侣来促进病毒进入。为了确定潜在的候选者，作者们探索了包括13种人类组织的119种细胞类型在内的单细胞基因表达图谱，并分析了51种报道的RNA病毒受体和400种其他膜蛋白的单细胞共表达谱。与其他近期报道一致，作者们证实ACE2主要在肺AT2，肝胆管细胞，结肠细胞，食道角质形成细胞，回肠ECs，直肠ECs，胃上皮细胞和肾近端小管。有趣的是，作者们发现，候选共受体与ACE2在13个人类组织中表现出最相似的表达模式，都是肽酶，包括ANPEP，DPP4和ENPEP。其中，ANPEP和DPP4是人类CoV的已知受体，这表明ENPEP是人类CoVs的另一种潜在受体。作者们还进行了“ CellPhoneDB”分析，以了解CoV靶标及其周围不同组织周围细胞之间的细胞串扰。作者们发现巨噬细胞经常通过趋化因子和吞噬作用信号与CoVs靶标通讯，突显了组织巨噬细胞在免疫防御和免疫发病机制中的重要性。
样品数据
从GEO（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）或Human Cell Atlas（https://www.humancellatlas.org）下载每个单个细胞的基因原始计数或标准化的基因表达矩阵。
收集了13种组织的单细胞基因表达数据，包括肝，肺，结肠，回肠，直肠，血液，脾脏，骨髓，眼睛，皮肤，胃，食道和肾脏。
可从病毒受体数据库（Viral Receptor database）（http://www.computationalbiology.cn:5000/viralReceptor）下载高质量的病毒-宿主受体相互作用信息，该数据库管理了152对哺乳动物病毒-宿主受体相互作用和来自9种哺乳动物的51种病毒受体。膜蛋白是从Membranome数据库（https://membranome.org）中提取的。
数据分析
质量控制和规范化
原始计数矩阵（每个细胞每个基因的UMI计数）由Seurat处理。除去具有少于100个表达的基因（UMI计数> 0）和高于25％的线粒体基因组转录物的细胞。除去少于三个细胞中表达的基因。然后，作者们使用默认设置的“ NormalizeData”功能对基因表达数据进行标准化。使用“ ScaleData”函数实现去除批次效应使用UMI和线粒体基因表达数量。校正后的表达矩阵用于细胞聚类和降维。
细胞聚类，降维和可视化
细胞聚类和降维是通过Seurat包装进行的。在此之前，作者们通过Seurat软件包中的“ FindVariableGenes”功能,从校正的表达矩阵中选择2000个高度变化的基因（HVGs）,对它们进行居中和缩放。然后，作者们使用“ RunPCA”函数对HVGs进行主成分分析（PCA）。为了消除信噪比，作者们通过使用 JackStraw”函数来选择一些重要的主分量，该功能是通过置换测试实现的。具体来说，作者们首先确定了50个主要成分，然后根据“ ScoreJackStraw”函数产生的p值选择了重要成分，以进行进一步分析。使用harmony包去除批次效应。
利用“ FindClusters”功能对细胞进行聚类，然后将细胞嵌入PCA空间中的图形结构中。作者们将分辨率参数设置为0.8，以识别主要细胞类型，例如 T细胞，B细胞或巨噬细胞。然后使用“ RunUMAP”功能将分群的单元投射到二维空间上。聚类结果通过“ DimPlot”功能来可视化。
细胞类型识别
为了注释细胞簇，作者们首先通过执行“ FindMarkers”功能鉴定每个簇上差异表达的基因。然后根据选定的已知细胞标记对细胞簇进行注释。表达相同细胞标记的细胞簇被合并。
细胞间相互作用分析
作者们利用CellPhoneDB数据库“cellphonedb” 功能进行了细胞间相互作用分析。选择显著的细胞间相互作用，p值<0.01。
分析结果
在13个人体组织中细胞类型鉴定
作者们从肝，肺，直肠，结肠，回肠，血液，脾脏，骨髓，眼睛，皮肤，胃，食道，肾脏中分别获得了8443、43474、4248、5282、3279、30693、97695、17131、4335、11552、4871、8880、20197个细胞。然后，使用从已发表文章中搜索到的规范标记对细胞簇进行注释（图1）。作者们最终注释了来自13个人体组织的119种细胞类型。
各组织当中的细胞类型（）
ACE2，ssRNA病毒受体和其他膜蛋白在13种人体组织中的表达图谱
ACE2在13种组织中的表达模式
ACE2在肺，肝，胃，回肠，直肠，结肠，血液，骨髓，脾脏，食道，肾脏，皮肤和眼睛中的单细胞表达图。
作者们首先分析了ACE2在13种组织中的表达模式（Fig 1）。结果表明，ACE2在肺AT2，肝胆管细胞，结肠结肠细胞，食道角质形成细胞，回肠EC，直肠EC，胃上皮细胞和肾近端小管中表达，与最近的报道一致。但是，ACE2表达水平在肺AT2中相当低（比所有表达ACE2的细胞类型的平均表达水平低4.7倍）。作者们假设AT2细胞中共受体或其他辅助膜蛋白的出现可能促进nCoV的结合和进入。
然后，作者们分析了人类ssRNA病毒受体和膜蛋白的共表达特征。作者们从病毒受体数据库中收集了总共152对高质量的病毒-宿主受体相互作用，其中包含在9个宿主和96种病毒中的51个宿主受体。此外，从膜组数据库中提取了400种膜蛋白。总共分析了451个基因，其中95.7％（432/451）在13种组织中的至少一种中表达。
为了阐明ACE2与其他膜蛋白或病毒受体之间的潜在关系，作者们计算了精选库中每两个基因之间的Pearson相关系数。研究结果表明，有94个基因以基因表达方式与ACE2显着相关（P <0.01）。值得注意的是，ANPEP，ENPEP和DPP4是与ACE2相关的前三个基因（R> 0.8）（图2 ）。
巨噬细胞经常与表达ACE2的细胞相互作用
（Fig3 A）通过CellPhoneDB进行细胞间相互作用分析。细胞类型是节点，交互是边缘。红色节点表示在每个组织中表达ACE2的主要细胞类型。细胞类型的大小与与红色节点的交互总数成正比。
使用表达ACE2的细胞类型作为分泌配体的细胞，作者们计算了在各组织中每种类型细胞受体与分泌配体细胞相互作用的总数。结果，作者们发现巨噬细胞与肝，肺和胃中表达ACE2的细胞具有最高的活性相互作用（图3 A），共享一个CD74-MIF信号对（图3B）。CD74在抗原呈递细胞的细胞表面表达，并充当免疫细胞中细胞因子的受体。MIF，巨噬细胞迁移抑制因子，是参与炎症和免疫反应的促炎细胞因子。
（B）连接表达ACE2的细胞和巨噬细胞的细胞因子。巨噬细胞表达受体和表达ACE2的细胞表达配体。
靶向nCoV的细胞（表达ACE2）可以与不同组织中的各种细胞类型相互作用，尤其是肺，肝和胃中的巨噬细胞。在感染过程中，nCoV靶向细胞可通过CD74-MIF相互作用和其他信号传导途径募集巨噬细胞，发挥防御和破坏功能。