科研| FOOD CHEM：多组学联合分析灌溉对葡萄果实花青素生物合成的影响（国人佳作）
编译：寒江雪，编辑：谢衣、江舜尧。
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调节灌溉（RDI）是近年来发展起来的一种新型节水灌溉技术，非常适合干旱半干旱葡萄种植区。本研究通过组学研究揭示了RDI下葡萄花青素的合成。RDI使百粒重略有下降，可溶性固形物含量、果汁pH值、还原糖含量和总花青素含量增加，成熟前总酸含量下降。转录组和代谢组联合分析发现，RDI1上调了花青素生物合成途径中7个相关基因的表达水平，并增加了部分代谢物的含量。RDI组大部分单体花青素含量增加，成熟葡萄中Mv比例增加。总之，RDI是一种有效的节水灌溉方法，可以提高葡萄的花青素含量。
论文ID
原名：Transcriptomics integrated with metabolomics reveals the effect of regulated deficit irrigation on anthocyanin biosynthesis in Cabernet Sauvignon grape berries
译名：转录组学与代谢组学联合分析揭示了调节灌溉对赤霞珠葡萄果实花青素生物合成的影响
期刊：Food Chemistry
IF：6.306
发表时间：2020.1
通讯作者：孙翔宇&房玉林
通讯作者单位：西北农林科技大学葡萄酒学院
实验设计
本研究选择7年生的赤霞珠葡萄为实验材料。研究设置三个分组，分别为RDI1、RDI2和CK组。从葡萄出土到收获前30天，每组分别按估计的蒸散量（ETc）浇水。分别用30%ETc（RDI1）、50%ETc（RDI2）、100%ETc（CK）浇水。在开花后8、10、12、14和16周（WAF），对500个浆果重复取样，每个处理组有3个重复。随机抽取足够数量的浆果，测定取样后果汁的百粒重、还原糖含量、总酸含量、可溶性固形物含量和pH值，并进行转录组和代谢组的分析。
实验结果
1 RDI对葡萄果实理化指标的影响
不同RDI处理的葡萄百粒重如图1A所示。从图1A可以看出， RDI1组比对照组更早地减缓果实重量的生长和停止生长。在14WAF时，两组之间差异显著。图1B显示2018年RDI对葡萄还原糖含量的影响。在RDI处理下，10WAF时，葡萄果实中还原糖含量均高于对照组，且达到最高差异水平。葡萄果实成熟后，差异逐渐减小，但成熟时RDI组还原糖含量仍高于CK组。这与之前研究结果一致，主要是由于RDI上调了与糖卸载相关的基因。图1C显示了葡萄从变色期到成熟的总酸含量的变化。RDI组葡萄总酸含量显著低于CK组，尤其在10-12WAF。在12WAF时差异最大，而在成熟期差异不显著。葡萄中的总酸主要由酒石酸、苹果酸和柠檬酸组成。RDI组总酸含量的降低是由于这3种有机酸含量的降低所致。可溶性固形物含量与葡萄果实中各种物质的含量有关。糖度在成熟过程中继续增加（图1D），而RDI组的糖度增加更快。可溶性固形物含量主要取决于葡萄成熟时的还原糖含量，其变化与图1B基本相同。果汁的pH值随着水果的成熟而逐渐升高（图1E）。pH值很大程度上取决于葡萄的酸含量。RDI处理降低了有机酸的含量，从而提高了pH值。在10和12WAF时，各组pH值不同，RDI1组最高，CK组最低。总花青素含量（TAC）是本试验的关键指标之一。从图1F可以看出，在8WAF时，RDI组和CK组的TAC基本相同。在10-16WAF时，RDI组的TAC显著高于CK组。RDI处理不仅提高了果实的TAC，而且使变色期提前结束。RDI处理上调花青素生物合成相关结构基因表达，导致TAC含量增加。说明灌溉量不足会影响葡萄的营养生长和生殖生长，导致葡萄早熟。
RDI处理降低了浆果的重量、产量和可滴定酸度，提高了总可溶性固形物和总花青素含量。适当的RDI处理可以在稍微减少果园面积的情况下提高赤霞珠葡萄的品质。这种水果品质的提高对酿酒葡萄尤为重要，这在一定程度上直接关系到果实的经济价值和最终葡萄酒的品质。RDI处理有效地减少了灌溉水量，很好地适应了西北干旱半干旱地区的环境。
葡萄生长很大程度上受土壤含水量的影响。RDI的主要功能之一是通过改变藤本植物的根冠比来改善浆果的品质，因为它既能延缓营养生长，又能促进生殖生长。这种灌溉处理会引起葡萄树的叶片大小、叶形和边界层厚度等树器官的变化，从而改变葡萄树的小气候，从而引起温度的变化，光照强度和光照时间直接或间接影响葡萄花色苷的生物合成和积累。
2转录组数据分析
从图1F分析，8-12WAF时花青素迅速积累，选择10WAF时期的浆果进行转录组分析。图2A展示了样本间的相关性，图2B展示RDI和CK组的不同组合之间的共有DEG。图2C和图2D中绿点代表下调基因，红点代表上调基因。转录组分析发现RDI1与CK间有3991个DEG，其中1687个上调，2304个下调。RDI2与CK共有1198个DEG，其中上调基因403个，下调基因795个。RDI影响了葡萄中很多基因的表达，且随着水分亏缺程度的加深，DEG的数量增加。
筛选黄酮生物合成途径下游的花青素合成基因。差异基因表达量热图如图2E和F所示。RDI1组和CK组之间的差异更为显著。对差异基因进行GO注释分析发现不同程度的RDI会对葡萄细胞参与代谢过程的DEG数量有较大影响，但DEG参与代谢的比例与总DEG的比例相似（图3）。
3花青素生物合成基因的表达
对花青素生物合成途径中8个关键基因的相对表达水平进行了RT-PCR检测（图4）。RDI两组在8～14WAF时VvPAL的表达均显著高于对照组，两组VvPAL的表达均显著高于对照组，且在14WAF时差异达到最大值时差异最显著。但在成熟期RDI两组的表达水低于对照组。随着果实逐渐成熟，VvC4H的表达逐渐降低。成熟期，RDI组VvC4H表达低于CK组。8WAF时 VvF3'5'H的表达在RDI1中明显上调，VvUFGT在RDI1中也显著上调。在8WAF时，RDI组VvLDOX的表达均显著低于CK组。
当葡萄水分亏缺时，花青素生物合成途径中的8个关键基因在不同时期表现出不同程度的表达变化。VvPAL、VvC4H、VvCHS和VvDFR在变色期上调，在成熟期下调。VvLDOX在果实发育初期下调，随后逐渐升高，直至果实成熟。在葡萄不同的成熟期，不同基因对水分亏缺的反应不同。随着缺失程度的不同，同一基因在同一时期也会有不同的表达。葡萄糖和果糖的增加促进了VvDFR的表达，因此RDI1处理后花色苷途径中的VvDFR基因表达上调。
除了本研究所涉及的花青素生物合成途径中的结构基因外，MYB家族转录因子作为调节基因是影响花青素生物合成的最重要的转录因子。由于MYB基因的突变，一些白葡萄品种没有花青素的积累。对转录因子VvMYB5a和VvMYB5b研究发现它们主要调节果实生长早期的类黄酮代谢途径，直接影响到葡萄花青素、黄烷醇和木质素等多种多酚的代谢。因此，在本研究引起代谢产物积累变化的众多因素中，转录因子在表达水平上的变化是可能的原因之一，这一点在本文中没有涉及，需要进一步的研究和证明。
4不同代谢物在贮藏过程中富集花青素生物合成途径
本实验检测了赤霞珠中期（10WAF）浆果中的多种单体花青素、黄酮和黄酮醇，并进行了代谢组学分析。在各组比较中，鉴定到65种差异代谢物，有18种共有差异代谢物（图5B）。图5C和D分别展示了RDI1和RDI2与CK相比的差异代谢物。其中RDI1有37个上调的代谢物，1个下调代谢物。RDI2有30个上调和2个下调代谢物。灌溉量与花青素相关代谢产物的含量密切相关。随着水分亏缺的增加，上调代谢产物的数量增加。
34种单体花青素和黄酮类化合物的两个聚类热图谱见图5E和F。与CK组相比，RDI1对大多数花青素的含量有显著的上调作用，而对某些花青素前体如苦参酸、二氢槲皮素和二氢杨梅素的含量有显著的下调作用。在RDI2组和CK组相比，上述三种前体物质的含量仍然表现出显著的下调，芦丁等黄酮类物质的含量也同样下调。这表明在RDI处理过程中，花色苷生物合成途径中许多花色苷和类黄酮的含量均发生了显着变化，尤其是在缺水最严重的RDI1组中。
5 RDI处理对葡萄皮单体花青素的影响
测定了葡萄皮中5种主要单体花青素从变色期到成熟期的含量，包括花青素-3-O-葡萄糖苷（Cy），飞燕草素-3-O-葡萄糖苷（Dp），芍药苷-3-O-葡萄糖苷（Pn），牵牛花色素-3-O-葡萄糖苷（Pt）和锦葵素-3-O-葡萄糖苷。各处理组的Cy含量随葡萄成熟度的增加而逐渐增加，在8WAF时含量较低。Dp的含量与Cy有显著性差异，在8WAF时，各组含量相近。10WAF时，RDI组Dp含量迅速增加，CK组稍有增加。各组Pn含量先升高后略有下降，组间差异不显著。RDI组与CK组Pt含量变化趋势有显著性差异。RDI组中Pt含量从8-10WAF迅速增加，然后基本保持稳定。CK组Pt含量随时间逐渐增加，但在14～16WAF时下降。My含量随果实发育而增加，在12-16WAF期间，RDI1和RDI2组的My含量略有增加，CK组基本保持不变。Mv在RDI1组中所占比例最高。
在花青素的检测和分析中发现，在果实成熟的早期（14-16WAF），各种单体花青素含量迅速下降。这种现象可能是由下游代谢反应的激活引起的。在水分亏缺条件下，不同类型的单体花青素与不同的积累比例有关。多数单体花青素在RDI处理下积累较快，花青素含量达到最大值的时间延长。少量单体花青素（如Pn）对RDI不敏感。因此，总体累积速率和趋势与正常灌溉组相似。在RDI处理下，赤霞珠不仅在变色过程中花青素含量增加，而且在成熟过程中花青素含量仍明显高于正常灌溉组。
6 RDI处理对花青素生物合成途径的影响
RDI组的L-苯丙氨酸含量与CK组相比无显著变化，VvPAL基因产生的肉桂酸含量呈显著上调。在VvC4H、Vv4CL和VvCHS的作用下产生柚皮苷，在这一过程中，RDI1组表达明显上调。RDI组的柚皮苷含量略有上调，RDI1组上调幅度较大。柚皮苷在VvF3'5'H和VvF3'H的作用下产生了圣草素和二氢杨梅素。三种黄酮类化合物的下游产物DHK、DHQ和DHM存在差异。RDI1组DHK无明显变化，RDI2组DHK略有升高。DHQ含量在RDI组略有下降，DHM含量显著下降，而VvF3H的表达在RDI组升高。这三种二氢黄酮醇在VvDFR、VvLDOX和VvUFGT三个基因的作用下，产生多种花青素。其中，VvLDOX在RDI1组中表达明显上调，VvUFGT基因在RDI组均表达上调。
分析图6所示代谢通路，作为飞燕草素代谢途径下游产物的MV、Pt和Dp的单体花青素含量在两个RDI组中均显著增加。与其他单体花青素相比，Mv占总花青素的比例最大，推测TAC的大幅度增加是由于水分亏缺时Mv含量急剧增加所致。DHM作为Mv、Pt和Dp的上游前体，在两个RDI组中均呈显著下降趋势，这似乎是一个矛盾的结果，这可能是由于上游代谢物二氢杨梅素的含量较低或下游代谢物黄酮醇的分解，因此，这些都是特定的原因至于为什么需要进一步研究。
结论
本研究揭示了RDI对赤霞珠葡萄果实花青素生物合成的影响。RDI提高了可溶性固形物含量、果汁pH值、还原糖含量和总花青素含量，但降低了百粒重。成熟前总酸含量降低。RDI1组与CK组比较差异最为显著。转录组学和代谢组学分析显示，随着水分亏缺的增加而差异基因和差异代谢物数量增加。在RDI1下，花青素生物合成途径关键基因的相关表达水平被上调。肉桂酸、柚皮素查尔酮、柚皮素、枇杷叶苷等代谢产物的含量均显著增加。多数单体花青素含量增加。随着灌水量的减少，Mv所占比例增加。本研究分析揭示了RDI影响花青素生物合成的机制。研究结果为进一步研究水对花青素积累的调节作用奠定了基础。这些研究最终将有助于促进RDI测量，有助于提高葡萄酒葡萄的质量。
评论
本研究利用生物化学和转录组学结合代谢组学的方法，阐明RDI对赤霞珠浆果花青素生物合成和代谢的影响机制，为阐明RDI处理后的花青素代谢途径提供更多依据。从整体经济学的角度解释RDI的作用，为酿酒葡萄的生长提供理论依据和指导。