科研 | PBJ：植物激素如何影响种子活力？（国人佳作）
编译：寒江雪，编辑：十九、江舜尧。
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本研究以水稻为材料，克隆糖基转移酶基因OsIAGLU，并对其在种子活力中的作用进行了研究。OsIAGLU基因的突变导致水稻种子活力降低。在种子发育后期和萌发早期，OsIAGLU的表达相对较高，且受吲哚乙酸（IAA）和脱落酸（ABA）诱导。转录组分析表明，IAA和ABA相关基因参与OsIAGLU调控种子活力。与野生型（WT）相比，osiaglu突变体萌发种子中游离IAA和ABA含量较高。经过外源IAA和ABA处理后，突变体和WT对ABA敏感，而对IAA不敏感，但外源IAA使得由ABA诱导的种子活力降的更低。与野生型相比，osiaglu突变体萌发种子中OsABI3和OsABI5持续高表达。OsIAGLU通过调节IAA和ABA水平来调控水稻种子活力。研究人员又对种质资源SNP进行分析，确定了两个与种子活力呈正相关的单倍型。本研究为深入了解OsIAGLU在水稻种子活力中的作用提供了重要的依据，也为OsIAGLU在水稻育种中的实际应用提供了便利。
论文ID
原名：Indole-3-acetate beta-glucosyltransferase OsIAGLU regulates seed vigour through mediating crosstalk between auxin and abscisic acid in rice
译名：3-乙酸吲哚β-葡萄糖基转移酶OsIAGLU通过水稻中生长素和脱落酸之间的互作来调节种子活力
期刊：Plant Biotechnology Journal
IF: 6.84
发表时间：2020.3
通讯作者：王州飞
通讯作者单位：华南农业大学农学院
DOI号：10.1111/pbi.13353
实验设计
本研究分别测定野生型和osiaglu突变体的种子粒活力。以野生型为模板扩增OsIAGLU基因对其功能进行研究，包括表达模式分析及亚细胞定位等。选取野生型和突变体子粒发育过程中开花后0, 7, 14, 21和28天（DAF），发芽过程中吸胀后0，4，8，12，18，24，36，48，60和72h的子粒进行转录组测序，对差异表达基因进行代谢通路分析。再分别用GA，IAA和ABA处理野生型和突变体，测定表型验证基因的调控作用。最后通过SNP进行单倍型分析寻找籼粳稻之间的差异。
结果
1 OsIAGLU突变导致种子活力降低
水稻OsIAGLU位于第11号染色体上，推测含有504个氨基酸。系统发育树表明与玉米中的IGAU关系较近。为了进一步验证OsIAGLU的功能，研究人员利用CRISPR / Cas9构建了突变体osiaglu-1、osiaglu-2 和osiaglu-3（图1a）。osiaglu-1、osiaglu-2和osiaglu-3突变株在OsIAGLU的外显子上分别含有59、58和5bp的缺失（图1b）。OsIAGLU的突变导致种子发芽速度降低和幼苗生长缓慢。与WT相比，osiaglu-1，osiaglu-2和osiaglu-3的发芽率提高了50％，而发芽指数和幼苗活力指数显着降低（图1c-g）。大田环境下，三个突变株系的出苗率和幼苗生长性状（包括根长、茎长和幼苗干重）均显著低于野生株系（图1h-l）。所有这些结果表明，OsIAGLU在水稻种子活力调控中起重要作用。
2 OsIAGLU和表达模式分析和亚细胞定位
RT-PCR结果显示开花后0～28天（DAF），籽粒中OsIAGLU的表达量逐渐增加，28DAF后急剧增加（图2a）。早期种子萌发吸胀4h时，OsIAGLU的表达量较高（图2a）。在12～72h内，IAA和ABA均能明显诱导OsIAGLU的表达，IAA和ABA的诱导作用强于GA（图2b）。GUS染色发现对照组、IAA和ABA处理条件下，在萌发种子的胚和芽中，OsIAGLU在12-72h内均呈高表达（图2c）。亚细胞定位结果说明OsIAGLU在细胞质中特定表达（图2d）。OsIAGLU在种子萌发过程中的特异表达表明它在调节种子活力中起作用。
3 OsIAGLU调控种子萌发过程中IAA和ABA水平
为了进一步研究OsIAGLU的功能，选择吸胀72h的osiaglu-2和WT转录组数据进行差异分析。两组间鉴定到9121个差异表达基因（DEG），与WT相比，osiaglu-2中有3148个基因显著上调，5973个基因显著下调（图3a）。通过MapMan分析，有222个DEG显著富集在激素代谢。其中，大多数与激素相关的DEG参与了IAA(77)、ABA(23)、茉莉酸(JA)(22)和乙烯(ETH)(60)的代谢（图3b）。
RNA-Seq数据表明OsIAGLU参与种子萌发过程中IAA和ABA代谢的调节。因此推测在水稻种子萌发过程中，OsIAGLU调节IAA和ABA的水平。与WT相比，突变体种子萌发后的12-72小时内，IAA和ABA水平普遍升高（图3c-d）。在成熟的种子中osiaglu突变体的IAA和ABA水平普遍也高于WT。结果表明，OsIAGLU对种子萌发过程中内源IAA和ABA水平有明显的调节作用。
4 OsIAGLU调控种子活力与ABA与IAA相互作用有关
OsIAGLU影响种子萌发过程中的游离IAA和ABA水平，突变体中较高的游离IAA和ABA积累可能导致种子活力降低。用5 μM和10μM外源IAA和ABA处理种子，发现外源施加IAA，对照组、WT及突变体种子活力（发芽时间、发芽率和发芽指数）没有明显差异（图4a）。在外源IAA存在下，不同处理和对照的osiaglu突变体和WT植株的种子活力，包括50%发芽率、发芽率和发芽指数，均无显著差异（图4b-d）。但突变体和WT植株的种子活力显著降低，且突变体种子活力最低（图4e-g）。与WT相比，osiaglu突变体ABA更敏感且种子活力较低。在外源ABA加入的同时加入不同浓度的IAA（图5），发现与ABA处理相比，IAA+ABA处理显著降低了种子活力，说明外源IAA使得ABA介导的水稻种子活力更低。这些结果表明，OsIAGLU基因敲除使得过量的ABA和IAA积累以及它们在水稻中的相互作用导致种子活力降低。
5 OsIAGLU调控种子活力与OsABIs表达中有关
RNA-seq结果发现与IAA相关的DEG，包括TIR1（1）、AUX/IAA（15）和ARF（9）都参与了IAA信号传导过程（图6a），与ABA相关的DEG，包括ABA合成/降解（10）、ABA信号转导（5）和ABA应答基因（8）参与ABA信号转导过程，与ABA相关的DEG，包括ABA合成/降解（10）、ABA信号转导（5）和ABA应答基因（8）也都参与ABA信转导过程（图6b）。与WT相比，突变体植株在72h时，ARF，ABA相关基因表达量升高（图6a，b）。说明在水稻种子萌发过程中，OsIAGLU通过调节IAA和ABA信号调控种子活力。
图6水稻水稻OsIAGLU在种子萌发过程中改变了IAA和ABA信号传递相关基因的表达。
ABI是ABA信号通路的下游因子，在种子萌发过程中起着关键作用。在水稻种子萌发过程中，OsABI3和OsABI5的表达受OsIAGLU的调控。OsABI3和OsABI5在对照组和IAA和ABA处理组中的表达情况见图7a-d，在突变体中的表达量高于WT（图7e和f）。分析两个基因在不同时间段的表达模式发现，OsABI3和OsABI5在种子萌发过程中的持续高表达导致了osiaglu突变体植株种子活力的降低。
6 OsIAGLU单倍型与种子活力的关系
本研究发现籼稻品种的种子活力比粳稻品种更强（图8a和b）。为了研究OsIAGLU等位基因的变化是否与两个亚种之间种子活力的差异有关， 对OsIAGLU上游2kb到下游1kb区域的SNP进行分析。在这些材料中鉴定出5个OsIAGLU单倍型（图8c）。与种子高活力相关的Hap 1和Hap 2与主要存在于籼稻,与种子低活力相关的Hap 3、Hap 5主要存在于粳稻，Hap 4两者都有。与Hap 3、Hap 4或Hap 5相比，Hap 1和Hap 2中OsIAGLU的表达量更高（图8c-e）。因此研究人员推测OsIAGLU的SNP在种子萌发过程中影响基因表达量，从而调节种子活力。与Hap 3、Hap 4或Hap 5单倍型相比，含有Hap 1或Hap 2单倍型（高种子活力）的材料中OsIAGLU的表达显著增加（图8f-g）。因此OsIAGLU变异与粳稻和籼稻种子活力差异相关。
结论
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