科研 | CELL STEM CELL：线粒体影响与年龄相关的造血干细胞功能异质性
编译：Champion，编辑：景行、江舜尧。
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衰老与造血干细胞（HSC）区室的适应性降低和髓系偏倚增加相关，导致免疫受损、贫血和恶性肿瘤的风险增加。本研究表明，线粒体膜电位（MMP）可用于前瞻性分离老年的HSC和具有转录特征和功能属性的年轻HSC。MMP是比实足年龄这个因素更强能决定HSC定量和定性转录状态因素，在其天然微环境内操纵HSC中MMP的转录后果表明存在因果关系。因此，研究表明，老年HSCs中MMP的药理作用增强可增加移植后的植入潜能，并在稳定状态下逆转由骨髓偏向的外周血输出。本研究证明MMP是老HSC异质性的来源，它的药理学操作可以改变转录程序，对HSC功能产生有益的作用。
论文ID
原名：Mitochondrial Potentiation Ameliorates Age-Related Heterogeneity in Hematopoietic Stem Cell Function
译名：线粒体影响与年龄相关的造血干细胞功能异质性
期刊：Cell Stem Cell
IF：20.86
发表时间：2020年10月
通讯作者：Tariq Enver
通讯作者单位：瑞典隆德大学
DOI号：10.1016/j.stem.2020.09.018
实验设计
结果
研究比较了老年和年轻HSCs的线粒体活性，并评估了线粒体参数的年龄相关变化在多大程度上适用于有机体内的全部或仅一小部分HSCs。在VP（抑制剂）存在下对线粒体质量或膜电位的染色与一组细胞表面标志物相结合，以区分幼鼠和老年鼠骨髓中的干细胞、祖细胞和成熟细胞（图1A）。与已发表的文献一致，研究人员观察到免疫表型造血干细胞的频率随着年龄的增长而显著增加（图1A）。首先验证了VP对HSCs与BM细胞线粒体染料保留的影响。在缺乏VP的情况下，幼年和老年动物的原始祖细胞（Lin-Sca1+cKit+；LSK）和HSCs的MMP似乎都低于承诺的BM群体（Lin+）。研究表明，VP的加入显著增加了HSCs中所有线粒体质量和MMP染料的染色强度，而不影响总的BM染色（图1B）；因此，研究人员在整个研究过程中都使用了VP。根据相关研究的数据证实，相对于成熟的骨髓群体，造血干细胞的线粒体质量和MMP确实较高，这一趋势在幼鼠和老年鼠中都观察到了（图1C）。另外，随着年龄的增长，造血干细胞中的线粒体膜电位显著减少（图1D）。表明在老年造血干细胞中，线粒体质量的活性下降。
对MMP值分布的评估显示，年轻和老年造血干细胞相对于MMP值是不同的，年轻和老年HSC覆盖的MMP值范围大致相似（图1E）。在人群水平上的平均MMP值的差异是由于老年HSC的分布向该范围的低端移动，而年轻HSC的分布则向高端移动。研究将HSC分类为MMPhigh或MMPlow，基于此，幼鼠体内的大多数HSCs被归类为MMPhigh。相比之下，只有10%-15%的老年小鼠的造血干细胞被归类为MMPhigh，而MMPlow部分代表了大多数老年HSC（图1E）。接下来，研究通过染料染色确认研究在手术中定义为MMPhigh的细胞表达高水平的关键线粒体基因，包括Cox8a、Pmpca和Mff（图1F），证实了研究对MMP状态的评估。此外，研究还探讨了基质金属蛋白酶与其他代谢参数的关系。研究的数据显示，幼年和老年小鼠HSC的线粒体膜电位与其细胞内ATP含量呈正相关（图1G），与线粒体超氧化物歧化酶和细胞内ROS呈负相关。这一点特别令人感兴趣，因为众所周知，低ROS水平支持长期的HSC功能。综上所述，造血干细胞对基质金属蛋白酶具有异质性，老年小鼠体内存在一组基质金属蛋白酶高干细胞，其基质金属蛋白酶与大多数年轻造血干细胞相似。
图1. 线粒体活性是老年和年轻HSCs异质性的来源。（A）左：HSPC的门控策略基于谱系Sca1+cKit+组分（LSK）中信号淋巴细胞激活分子（SLAM）的表达。右：表型造血干细胞（CD150+CD48-LSK），多能祖细胞（MPP，CD150-CD48-LSK），以及更受限制的祖细胞群体HPC1（CD150+CD48-LSK）和HPC2（CD150+CD48+LSK）在老年和幼鼠中的频率。（B）HSCs（蓝色）和Lin+（灰色）细胞的典型FACS图谱，在无VP（上）或存在VP（下）的情况下，用TMRM测量。（C）分析幼鼠骨髓、Lin+和祖细胞（LSK）的线粒体质量（MTG）和潜能（TMRM）。（D）比较年轻（蓝色）和老年（紫色）骨髓系的线粒体质量（MTG；左）和潜在线粒体质量（TMRM）。（E）年轻（蓝色）和老年（紫色）造血干细胞MMP值的FACS代表性曲线图（上），包括分析属于MMPhigh（绿色）和MMPlow（红色）类别的年轻和老年HSC的百分比分布（下）。（F）年轻和老年LSK细胞中Cox8a、Pmpca和MFFmRNA的表达。（G）年轻和老年小鼠的30%MMP最低和最高分选的HSCs中ATP含量的测量。
2 线粒体膜电位决定造血干细胞转录率
在这里，研究使用转录速率作为转录状态的定量测量，在造血干细胞的天然BM生态位的背景下探索这种关系。研究测量了体内的转录速率，使用Click-it化学检测了在腹腔注射后一段设定的时间内5-乙炔基尿苷（5-EU）掺入新生RNA中（图2A）。值得注意的是，在幼鼠中，造血干细胞和祖细胞（HSPC）的转录速度尤其快于承诺的BM谱系（图2B）。尽管RNA转录速度很快，年轻和老年造血干细胞显示出较低的蛋白质翻译率（图2C）。与其较低的基质金属蛋白酶水平相一致，老年小鼠的造血干细胞和祖细胞表现出明显低于年轻小鼠的转录速率（图2D）。荧光激活细胞分选（FACS）分析表明，老年和年轻的造血干细胞的转录速率和基质金属蛋白酶的转录速率一样不均匀（图2E）。将造血干细胞分为转录速率“快”（橙色）或“慢”（灰色）显示，有一小部分老年造血干细胞的转录速度与大部分年轻造血干细胞一样快（图2E）。为了进一步探讨基质金属蛋白酶与转录速率的关系，研究对体内掺入标记5-EU后的MMPlow和MMPhighHSPC进行了分类，并对它们的转录速率进行了分析。研究的结果证实，无论是幼鼠还是老年鼠，MMPhighHSCs转录RNA的速度都快于MMPlowHSCs（图2F）。为了进一步验证MMPhigh和转录速率“快速”的HSPC之间的相似性，对MMPlow和MMPhigh分选的HSPC和HSC中的RNA聚合酶II（RNA-Pol-II）亚单位和延伸因子Ell2等对mRNA转录起关键作用的基因进行了基因表达分析（图2G）。这些数据表明，在幼年和老年小鼠中，与MMP低分选细胞相比，MMP高分选细胞中对RNA-Pol-II驱动的转录至关重要的基因显著上调，证实了这一关系。相反，RNA Pol I转录终止因子1（Ttf1）的表达似乎与基质金属蛋白酶无关。体内用线粒体解偶联剂羰基氰基间氯苯肼（CCCP）处理后，基质金属蛋白酶（MMPs）减少，包括造血干细胞在内的骨髓细胞（图2I）的转录速率显著降低。为了解决转录速率是否直接依赖于MMP的问题，研究比较了CCCP和传统RNA Pol抑制剂的效果（图2H）。线粒体解偶联引起的转录速率下降的幅度类似于广泛的RNA Pol抑制剂放线菌素-D以及类似浓度的RNA-Pol-II特异性抑制剂5，6-二氯苯并咪唑1-b-D-呋喃核苷（DRB）和黄嘌呤醇（图2I）。此外，从CCCP处理的动物中分离出的HSPC的基因表达数据显示，RNA-Pol-II亚基的特异性下调以及线粒体基因的下调。造血干细胞在其本土生态位中的转录速率既是异质的，又依赖于线粒体的活性。
图2.线粒体膜电位决定造血干细胞的转录速率。（A）体内转录和翻译速率的测量示意图。（B）正常小鼠骨髓的幼鼠骨髓谱系的体内转录速率测量。（C）小鼠骨髓细胞系的体内蛋白质翻译率测定。（D）比较年轻（蓝色）和老年（紫色）BM谱系的转录速率。（E）年轻（蓝色）和老年（紫色）造血干细胞转录速率的FACS代表性图谱（左），包括分析年轻（橙色）和低转录速率（灰色）类别的年轻和老年造血干细胞的百分比分布（右）。（F）从幼年或老年（18-24月）小鼠分离的30%MMP最低和最高分选的HSCs中的转录速率分析。（G）RNAPolⅡ亚基Polr2a、Polr2e和延伸因子Ell2以及RNAPolⅡ转录终止因子1（Ttf1）在年轻和老年LSK细胞中的mRNA表达。（H）实验程序示意图。（I）用线粒体解偶联剂CCCP体内处理HSCs后，比较三种浓度的RNA Pol抑制剂放线菌素D、DRB和黄嘌呤醇对HSCs转录速率的影响。
3 线粒体活性分离转录上不同的HSCs亚群
接下来，研究通过批量RNA测序（RNA-seq）评估了MMP中不同的HSCs的定性转录状态。如图1所示，MMPhigh和MMPlowHSCs是从幼鼠和老年鼠中分离出来的，尽管加强了高低之间的分离，使其覆盖了每个样本的30%（图3A）。利用基因集浓缩分析（GSEA），研究验证了MMPhigh和MMPlowHSCs在转录水平上适当地反映了它们的线粒体状态（图3B）。主成分分析（PCA）显示HSCs主要按MMP分组，而不是按年龄分组（图3C）。大约1000个基因在MMPhigh和MMPlowHSCs之间有显著的差异表达（图3D）。最近邻分析（图3E）显示，无论供者年龄如何，MMPhigh和MMPlowHSCs之间的差异表达基因比年轻和老年HSCs之间的差异表达基因更多。总体而言，这表明基质金属蛋白酶是转录状态的一个比年龄更大的决定因素，虽然作为一个群体，老年造血干细胞与年轻的造血干细胞在转录上有很大的不同，但有一小部分确实与年轻的造血干细胞有显著的转录相似性，这些都可以通过基质金属蛋白酶来识别。接下来，研究探讨了共享相同基质蛋白的细胞转录相似性的潜在基础。GSEA（图3F）揭示了与低基质金属蛋白酶相关的年龄相关特征。关键的是，炎症的上调和DNA修复的下调是肿瘤发生的驱动因素，可能与白血病的强烈年龄依赖性有关。GSEA还显示，MMPhighHSCs富含与转录速率相关的途径，包括嘌呤和嘧啶代谢、RNA周转和剪接体途径。此外，GSEA将研究的原始数据集与已发表的谱系特征进行比较，发现与MMPhighHSCs相比，MMPlowHSCs的粒细胞和单核细胞祖细胞（GMP）特征丰富，红系、早期红系、Pro-B和早期T细胞程序下调（图3F）。为了更全面地评估与基质金属蛋白酶相关的谱系，研究使用了细胞雷达，它将选定的基因组与已发表的线性相关基因进行比较。这些数据表明，MMPlowHSC主要浓缩为粒细胞、单核细胞和长期HSC（LT-HSC）信号（图3G），其方式与细胞雷达对HSC老化后上调基因的分析几乎相同（图3H）。相反，在MMPhighHSCs中上调的基因显示了更多样化的谱系模式，覆盖了许多淋巴系、红系和混合血统的前体群体（图3G），其方式更类似于细胞雷达对年轻HSC中上调的基因的分析。最后，使用文献衍生的候选基因方法测试了基质金属蛋白酶和血统之间的联系；与髓系或血小板偏见有关的年龄相关基因在MMPlowHSCs中几乎只上调，而涉及淋巴和红系启动的基因在MMPhigh HSCs中上调（图3D）。研究从这些数据中得出结论，无论年龄大小，基质金属蛋白酶都能使造血干细胞在数量和质量上分离出不同的转录状态。此外，基于低和高基质金属蛋白酶的细胞分选分别分离了年老和年轻的造血干细胞所特有的转录变化。
图3. 线粒体活性分离造血干细胞的转录不同亚群。（A）分类策略。（B）GSEA图比较了MMPlow和MMPhighHSCs的原始测序数据。（C）MMPhigh（H，绿色）和MMPlow（L，红色）的主成分分析从幼鼠（Y，三角形）和老鼠（O，圆形）中筛选出HSC。（D）无论供体年龄大小，MMPlowand和MMPhighHSCs之间的DEG热图，突出已知的谱系偏向基因。（E）相邻分析的距离，用种群间的距离来表示离散对数（黑色）。年轻人和老年人之间的重叠和特定的基质金属蛋白酶状态以绿色显示，其中更大的重叠代表接近。（F）基于GSEA的与低或高基质金属蛋白酶相关的显著上调或下调途径的例子。图S3C中的进一步分析。（G）细胞雷达图谱比较MMPlowHSCs和MMPhighHSCs中显着上调的基因，与供者年龄无关。（H）根据文献，无论供体年龄如何，MMPlowHSCs中基因的细胞雷达图都显著上调，而老年HSC与年轻HSC中基因的细胞雷达图都显著上调。
4 体内操纵基质金属蛋白酶改变造血干细胞转录状态
为了了解基质金属蛋白酶是否是转录状态的功能性决定因素，研究人员接下来对体内造血干细胞的基质金属蛋白酶水平进行了实验操作（图4A）。研究都通过注射CCCP（图2H）解偶联线粒体呼吸链，并使用线粒体靶向辅酶-Q10来增强线粒体膜电位（Mito-Q），这成功地增加了体外培养的老年造血干细胞的线粒体膜电位。研究发现，连续注射Mito-Q显著增强了老年HSC在其天然生态位中的线粒体膜电位，提高了它们的整体转录速率（图4B），并降低了它们的细胞内ROS水平。Mito-Q处理老龄小鼠引起了显著的频率从HSCs转移到HPC1组分。CD150的表达被用来区分主要偏向淋巴系的（Ly；CD150低）和偏髓系（My；CD150高）的造血干细胞，后者随着年龄的增长而变得主要（图4C和4D）。有趣的是，短期Mito-Q治疗通过选择性循环Ly-HSCs，导致Ly-HSCs显著增加（图4E）。这些变化与研究观察到的Ly-HSCs比My-HSCs有更高的MMP是一致的。
总体来说，这些结果表明用Mito-Q治疗5天的老年小鼠会引起HSC的表型变化，这暗示着功能状态的改变，但可能需要注意的是Mito-Q治疗可能会影响细胞表面标志物的表达。因此，研究评估了在年轻HSC中观察到的值增加老年HSCs的线粒体膜电位是否会增加它们与年轻HSCs的转录相似性，反之亦然。对从老年未经处理的动物（O）、老年Mito-Q处理的动物（O+MQ）、年轻的未经处理的动物（Y）和年轻的CCCP处理的动物（YCCCP）分离的HSC进行RNA测序（图4A）。有趣的是，PCA显示，从Mito-Q处理的动物分离的老年HSCs与年轻的HSCs在转录上的相似性比从未经处理的动物分离的老年HSCs更大。接下来，研究将样本分为“高MMP”和“低MMP”，前者由未经处理的年轻造血干细胞和通过Mito-Q治疗增强了MMP的老年造血干细胞组成，后者由未经处理的老年造血干细胞和通过CCCP线粒体解偶联后的年轻造血干细胞组成（图4F）。然后，研究发现与低MMP造血干细胞相比，高MMP造血干细胞中常见的基因上调和下调，与供者年龄无关（图4G）。同时，研究比较了所有旧样本和所有年轻样本，而不考虑治疗方法。无论捐赠者的年龄如何，在高MMP和低MMP样本之间差异表达的基因比在年老样本和年轻样本之间差异表达的基因更多，无论治疗方式如何（图4F）。尽管对基质金属蛋白酶的处理对转录状态的影响并不完全，但研究的数据表明，造血干细胞的基质金属蛋白酶，无论是自然发生的还是通过体内药理处理获得的，比供体小鼠的年龄对转录状态的影响更大。接下来，研究探索了在接受Mito-Q治疗的和年轻的未接受治疗的HSCs中普遍上调或下调的基因的性质，以评估对Mito-Q的反应所产生的转录状态变化是否暗示了功能状态的转变。差异表达基因（DEG）在较高的MMP样本中显著上调，与年龄无关，包括许多对HSC功能和自我更新至关重要的基因，包括许多转录因子（TF）（图4H）。此外，GO分析显示，年轻的未经处理的和老年Mito-Q处理的造血干细胞之间共享的最高上调的通路高度代表着转录速率的增加，也包括DNA修复通路的上调（图4H）。研究通过2Gy射线照射后DNA双链断裂（以γ-H2AX标记）的测量，从功能上验证了Mito-Q处理后HSCs的DNA修复能力的提高。研究发现，尽管稳态时y-H2AX水平没有差异，但经过Mito-Q处理的老年小鼠的HSCs，在照射后DNA损伤水平显著低于未处理的老年小鼠的HSCs。用MitoQ对暴露于体内照射的造血干细胞进行短期体外治疗也得到了类似的结果。此外，细胞雷达显示这些DEG与血统有关（图4I）。
图4. 在活体内操纵基质金属蛋白酶改变造血干细胞的转录状态。（A）利用Mito-Q或CCCP在老年（紫色）和幼年（蓝色）小鼠体内调节基质金属蛋白酶的策略。（B）MITO-Q（丁香酸）组与紫色组（紫色组）比较，MITO-Q组和紫色组HSC的MMP值（左）和转录率（右）的流式细胞仪（FACS）图谱。（C）左：经Mito-Q治疗5天后，老年（紫色）、幼年（蓝色）和老年小鼠的HSCs和HPC1的频率。（D）根据CD150的表达，对老年（紫色）、老年Mito-Q处理或年轻（蓝色）小鼠（n=4）的淋巴细胞（Ly）和髓系（My）偏向的造血干细胞进行定量。（E）根据CD150表达（Ly-HSC，黑色；My-HSC，灰色），在老年、老年Mito-Q处理或年轻小鼠（n=4）中循环的HSC的百分比（G1/G2M期）。（F）与邻居的距离分析将HSC样本按其基质金属含量（上）或按年代顺序的年龄（下）进行分组，使用DEG数作为距离的量度。（G）与CCCP处理的老年HSC和年轻HSC相比，经Mito-Q处理的老年小鼠的年轻HSC和年轻HSC的热图通常上调或下调。（H）左：所有转录因子（TF）通常在“高基质金属蛋白酶”样本中比“低基质金属蛋白酶”样本中上调。右图：对在高MMPHSC中表达上调的DEG进行的基因本体论分析。（I）细胞雷达图显示了与来自幼年（蓝色）或老年（粉色）小鼠的HSCs较高的基质金属蛋白酶相关的与老年（紫色）相对应的谱系潜力。
5 经Mito-Q处理的老龄小鼠的造血干细胞在移植后表现出优越的植入和传代动力学
为了评估MITO-Q治疗后HSC功能发生本质改变的程度，进行了竞争性移植试验。从经Mito-Q处理的老年小鼠（O+MQ，见图4A）或未处理的老年小鼠（O）分离出300个HSC，与100个年轻小鼠（Y）的HSCs和20万个BM支持的细胞竞争性地移植到致死性照射的小鼠中。外周血（PB）植入被监测到16周的终点，当骨髓植入也被分析时（图5A）。首先，研究评估被移植的HSC的基质金属蛋白酶是否影响其后代的基质金属蛋白酶。研究观察到年轻的供者造血干细胞重建了骨髓，在移植16周后，表现出与稳定状态下的幼鼠相似的跨系MMP值的趋势（图5B）。老年捐献者造血干细胞重建的血统比年轻捐献者造血干细胞来源的血统更低（图5B）。有趣的是，由旧的Mito-Q处理的供者造血干细胞重建的骨髓比来自未治疗的旧供者造血干细胞的骨髓具有显著更高的MMP，而在MMP方面与由年轻的造血干细胞重建的骨髓相似（图5B和5C）。此外，经过Mito-Q处理的和年轻的造血干细胞都重建了一个干细胞池，与来自未治疗的老年供者的干细胞池相比，该干细胞池的基质金属蛋白含量更高（图5C）。重要的是，重建动力学分析显示，从Mito-Q处理的小鼠分离的旧HSCs与未处理的旧HSCs相比，植入PB的能力明显更强（图5D）。Mito-Q处理小鼠的老年造血干细胞也显示出更好的谱系动力学，与免疫处理小鼠的老年HSC相比，产生的B细胞明显更多，同时髓系偏向输出的减少也更快（图5D）。移植16周后的骨髓植入反映了血液观察（图5E和5F），来自Mito-Q处理的老年小鼠的造血干细胞的植入几乎是未经处理的老年小鼠的2倍（图5E）。进一步的分析表明，O+MQ HSC的表现与其竞争对手一样好，包括年轻的HSC和支持BM的HSC，而未经治疗的旧HSC的竞争力明显高于他们的竞争对手（图5E）。因此，老年造血干细胞在线粒体增强后转录状态的改变伴随着植入潜力的增加、B细胞产量的改善和髓系偏见的减少，这表明短期体内Mito-Q治疗对HSCs的影响是细胞固有的，有趣的是，可以在干细胞移植后维持下去，从而对功能产生长期影响。
图5. 经Mito-Q处理的老年小鼠的造血干细胞在移植时表现出优越的植入和谱系动力学。（A）移植装置。（B）FACS分析移植后16周取材的骨髓系中的基质金属蛋白酶（TMRM+VP），按供者来源分离。左：取自未经处理的老供体造血干细胞；中：取自经Mito-Q处理的供体造血干细胞；右：取自年轻供体的造血干细胞。（C）移植16周后，未处理的老年供者造血干细胞（紫色，n=10）、经Mito-Q处理的老年造血干细胞（紫丁香，n=9）或年轻供者造血干细胞（蓝色，n=21）重建的骨髓（左）和右（右）骨髓中基质金属蛋白酶的比较。（D）接受未经处理的老年造血干细胞（紫色）或接受Mito-Q处理的小鼠的老年造血干细胞（粉红色）（左）的受者的总外周血细胞植入，以及B细胞植入（中）和髓系植入（右）的分析，与年轻联合移植的造血干细胞（蓝色，虚线）的动力学比较。（E）骨髓移植总量（左）和旧供体造血干细胞对竞争细胞的相对贡献（右）。（F）移植16周后（n=10-13），未处理（紫色）的老年小鼠（紫色）或经Mito-Q处理的（丁香）小鼠的造血干细胞（HSCs）的骨髓细胞、B细胞和前/前B细胞的百分比。
6 Mito-Q治疗对造血衰老表型的逆转和预防作用
因为干细胞在动态平衡环境下的行为可能与移植中看到的截然不同，研究接下来测试了Mito-Q在稳态状态下的造血活性，询问它能否逆转或阻止造血衰老，从而评估其在改善或预防与年龄相关的血液疾病方面的翻译潜力。研究在用Mito-Q治疗老龄小鼠之前、期间和5天后测量了外周血参数（图6A）。由于小鼠的衰老轨迹不同，导致18个月大的小鼠具有不同的年龄相关表型，因此研究单独监测接受Mito-Q治疗的小鼠。引人注目的是，每一只接受Mito-Q治疗的老动物在治疗开始和结束之间都表现出髓系输出的减少，幅度在2%到46%之间（图6B）。伴随而来的是B细胞产量的增加，除了一个个体外，所有个体的B细胞产量都增加了34%（图6C）。B细胞的质变也很明显，表现为免疫球蛋白-M表达（IgM+）B细胞的比例增加（图6D和S6A）。在Mito-Q治疗后，髓系细胞和B细胞的产量与未治疗的老年小鼠相比有显著变化，以至于它们不再与年轻小鼠有显著的不同（图6E）。重要的是，淋巴系和髓系产量的比例变化发生在没有改变总血细胞计数的情况下（图6F）。研究在一组较小的年轻和老年小鼠中延长了这些发现，在饮用水中使用或不使用Mito-Q的时间为10周，以评估给予Mito-Q的有效性以更符合任何潜在治疗用途的方式。在老年小鼠的饮用水中加入Mito-Q可产生与直接注射Mito-Q相似的髓系、淋巴系和红系动力学变化。补充幼鼠10周的饮用水对血液和骨髓参数没有显著影响。这些结果进一步提高了早期干预可能阻止或减轻衰老表型发生的可能性。为了验证这一点，研究给14月龄的中年（MA）小鼠补充了不加（O）或添加Mito-Q（OMQ）的饮用水，在5个月的时间里监测了单个小鼠的髓系细胞与B细胞的比率（图6G）。在实验开始时服用Mito-Q补充水的小鼠外周血中髓系细胞与B细胞的比率与MA小鼠相似，而自然衰老的小鼠则表现出明显的髓系偏向（图6H和图6G）。因此，用Mito-Q水老化的19个月龄小鼠的B细胞显著多于自然衰老的小鼠，而髓系细胞显著少于自然衰老的小鼠（图6H）。至关重要的是，Mito-Q治疗还防止了自然衰老引起的贫血的发生，服用Mito-Q水5个月的小鼠的红细胞计数、血红蛋白和红细胞压积显著增加就证明了这一点（图6I）。与PB的观察结果相一致，用Mito-Q补充水老化的老龄小鼠的骨髓中髓系细胞的比例显著低于自然老化的小鼠，而B细胞的比例则显著高于自然衰老的小鼠（图6J），包括由前B细胞和前B细胞组成的IgM-B220+隔室（图6J），以及成熟红系祖细胞（图6K）。总而言之，补充MA或老年小鼠Mito-Q分别导致衰老表型的减弱或部分逆转，突出了研究结果的翻译潜力。
图6. Mito-Q治疗可以逆转和预防造血衰老表型。（A）治疗方案示意图。（B）单独测量老年小鼠在治疗前（Pre）、治疗中期（MID）和治疗结束时（见图5A）外周血中髓系细胞（MAC1/Gr1+）的百分比，以及治疗前和治疗结束值之间的范围和平均（框）百分比变化。（C）与（B）相同，B细胞百分比（B220+）（n=15）。（D）老年（O，紫色）、年轻（Y，蓝色）和老年Mito-Q处理（O+MQ，丁香）小鼠B细胞IgM表达的代表性直方图。（E）老年小鼠（紫色）和O+MQ小鼠（紫丁香）和年轻小鼠（蓝色）治疗结束时外周血中髓系细胞和B细胞的分布。（F）Sysmex分析MitoQ治疗结束时老年小鼠的白细胞总数（WBC）、淋巴细胞百分比（LYM%）和绝对数（LYM#），并与未治疗的青年（蓝色）和老年（O）小鼠进行比较。（G）实验概述。（H）左：MA小鼠（绿色）和饮用正常饮用水（O，紫色）的老龄小鼠与Mito-Q水老化（O+MQ，丁香）小鼠的髓系/B细胞比率。右图：比较自然衰老（O，紫色）和用Mito-Q水（O+MQ，丁香）衰老的小鼠的外周血髓系细胞、B细胞和T细胞。（I）Sysmex全血分析自然衰老（O）或补充Mito-Q（O+MQ）小鼠的红细胞参数。（J）骨髓（M）、B细胞，以及自然衰老（O）或Mito-Q补充（O+MQ）小鼠的前B细胞（IgM-B220+）。（K）代表红系祖细胞群体的FACS图谱。
结论
本研究发现：（1）基质金属蛋白酶是老年造血干细胞异质性的来源，部分老年造血干细胞的基质金属蛋白酶水平与大多数年轻造血干细胞相似；（2）基质金属蛋白酶是决定造血干细胞数量和质量转录状态的重要因素；（3）造血干细胞的基质金属蛋白酶在体内是可以改变的；（4）基质金属蛋白酶的增强改变了老年造血干细胞的转录格局，包括挽救淋巴细胞红系程序和DNA修复途径；（5）基质金属蛋白酶是决定造血干细胞数量和质量转录状态的更大因素。（6）Mito-Q可以改善或防止衰老表型的发生。
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