科研 | Nature：拟南芥ELF3中一个朊病毒结构域起着温度传感器的作用

编译：秦时明月，编辑：夏甘草、江舜尧。

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导读

温度影响着植物的生长和发育，而气候变化已经改变了野生植物和农作物的物候。然而，植物感知温度的机制还不是很清楚。夜间复合体是植物生物钟的主要信号中枢和核心组成部分。夜间复合体作为温度响应转录抑制因子，通过未知的机制为植物生长提供节律性和温度响应性。夜间复合体由ELF3，一种大型支架蛋白和温度传感的关键成分；ELF4，一种小的α螺旋蛋白，以及LUX ARRYTHMO (LUX)，一种温度感应的关键成分组成。ELF3含有聚谷氨酰胺(PolyQ)重复序列，嵌入预测的朊病毒结构域(PrD)。本研究发现PolyQ重复的长度与热响应性相关。研究人员发现，在热带植物的ELF3蛋白中没有检测到PrD，其在高温下是活跃的，并且缺乏热响应性。ELF3的温度敏感性也受到ELF4水平的调节，表明ELF4可以稳定ELF3的功能。在拟南芥和异源系统中，ELF3与绿色荧光蛋白的融合以依赖于PrD的方式在几分钟内形成斑点，并以依赖于PrD的方式响应更高的温度。包含ELF3 PrD的纯化片段在体外响应温度上升可逆地形成液滴，这些性质反映了PrD的直接生物物理反应。温度通过相变使ELF3在活性和非活性状态之间快速转换的能力代表了一种以前未知的热敏机制。

论文ID

原名：A prion-like domain in ELF3 functions as a thermosensor in Arabidopsis

译名：拟南芥ELF3中一个朊病毒结构域起着温度传感器的作用

期刊：Nature

IF：42.778

发表时间：2020.07

通讯作者：Philip A. Wigge

通讯作者单位：剑桥大学

DOI号：10.1038/s41586-020-2644-7

实验设计

本研究构建了elf3-1, elf4-2以及elf4-101突变体，ELF4-OE以及ELF3-OE过表达植株，并杂交过表达与突变体植株以测定表型。回补实验使用天然的或35S启动子驱动的全长的拟南芥、Solanum tuberosum或Brachypodium disachyon ELF3 Q0-Q35序列转入elf3-1突变体。拟南芥嵌合ELF3植株通过BdELF3的相应序列替换PrD，并转入elf3-1中。以上植株全部进行RNA-seq以及qRT-PCR验证。以上序列连接Flag或GFP标签后转入elf3-1突变体中，以进行ChIP-seq、植物荧光观察、荧光褪色以及光散射试验。异源表达系统在酿酒酵母细胞中进行，并进行ELF3与ELF4的酵母双杂交试验。体外试验通过原核表达构建出拟南芥与Brachypodium disachyon ELF3 PrD蛋白，并进行液滴形成试验。

结果

1 ELF3的PolyQ重复序列被嵌入到预测的朊病毒结构域中，由ELF4调节并且对热反应是必不可少的

拟南芥ELF3含有一个PolyQ重复序列，在自然群体中的长度从7到29个残基不等，以前已经被认为与表型变异有关(图1a)。因此，研究人员调查了多聚Q重复的长度是否影响ELF3的活性。研究人员发现，在Col-0 (野生型)背景下，用编码增加的PolyQ长度的ELF3转基因回补elf3-1可以增强温度响应性。然而，改变PolyQ长度的影响是微效的，这与其他研究一致，而且没有PolyQ区的品系仍然对温度有反应。这表明ELF3的其他功能也对温度做出响应。由于PolyQ重复位于被预测为朊病毒结构域 (图1a)的中心，研究人员预测该结构域可能具有温度响应性。

如果ELF3的PrD确实在拟南芥的温度感应中起作用，研究人员想知道这个区域是否在适应不同气候的植物中有所不同。事实上，生长在温带气候的Solanum tuberosum的ELF3与拟南芥相比，预测的PrD较小，而习惯于温暖气候的Brachypodium disachyon预计不会有PrD区域(图1a)。由于加速开花是拟南芥对温暖温度的主要适应反应，研究人员研究了Solanum tuberosum ELF3 (StELF3)和Brachypodium disachyon ELF3 (BdELF3)是否会改变这一特性。结果表明，BdELF3和StELF3在拟南芥中具有功能，并回补elf3-1。在22 °C时，这些植物类似于野生型。然而，在27 °C时，它们几乎失去了所有对温度敏感的早花特征(图1b)；因此，这些减少或删除PrDs的ELF3突变体在很大程度上无法对高温做出反应。为了测试拟南芥ELF3的热响应是否归因于PrD本身，研究人员构建了一个嵌合序列，用相应的BdELF3序列替换了拟南芥的PrD。嵌合ELF3-BdPrD显示对温度敏感的开花受到抑制，证实拟南芥的PrD具有温度响应性(图1b)。

ELF3的活性是通过与小蛋白ELF4结合来调节的。为了了解ELF4是否参与ELF3的热响应，研究人员研究了温度对elf4-101和elf4-2植株下胚轴伸长和开花时间的影响。在22 °C和27 °C时，elf4等位基因的效应与elf3-1等位基因很相似，这与ELF4在夜间复合体中的关键作用一致。在17 °C时，ELF4对控制下胚轴伸长和开花时间都变得不可或缺，elf4-101和elf4-2植株的表型与Col-0植株相似(图1c)。这些结果表明ELF4在较高温度下具有缓冲ELF3的温度响应性的作用。研究人员假设过表达ELF4可能会稳定ELF3，正如体外研究所提示的那样。ELF4的表达是以昼夜节律的方式调节的，在一天结束时达到顶峰，在夜间迅速下降。研究人员观察到，结构性过表达ELF4的植物在很大程度上不能对温度做出反应，表明较高水平的ELF4的存在足以使ELF3即使在27 °C下也保持活跃状态。

由于ELF3是一个温度依赖的转录抑制因子，研究人员试图确定ELF3在靶基因上的占有率变化是否可以解释对温度反应的表型变化。结果表明，ELF3在靶基因上的占有率随着温度的升高而减少(图1d)。研究人员还发现，缺乏PrD的ELF3形式也失去了结合的温度响应性，表明PrD直接调节了ELF3与靶基因结合的温度响应性(图1e)。最后，ELF4的过表达也足以稳定ELF3的结合并取消温度响应(图1f)。

图1 ELF3的PolyQ重复序列被嵌入到预测的朊病毒结构域中，由ELF4调节并且对热反应是必不可少的。a，拟南芥ELF3 (AtELF3)含有一个嵌入了预测的朊病毒结构域的PolyQ重复序列(PrD)，而这个PrD信号在Brachypodium disachyon ELF3 (BdELF3)中不存在，在Solanum tuberosum (StELF3)中居中。b，ELF3 PrD对开花时间的温度控制是必不可少的。c，在较低的温度下，ELF4对于控制下胚轴的伸长变得不必要。d，根据ChIP-seq测定，ELF3与靶基因的结合依赖于温度，在高温时全基因组范围结合能力内下降。e，具有稳定形式的ELF3的转基因植株对温度没有反应。f，ELF4的过表达稳定了ELF3，并消除了其与靶基因结合的温度响应性。

2 高温在体内诱导形成ELF3斑点

由于ELF3作为转录调节因子发挥作用，研究人员试图确定观察到在靶基因上的占有率的变化是否对ELF3依赖的转录组有可检测的影响。研究人员通过筛选与LUX表达水平相似的转录本，包括PIF4和GI等夜间复合体的关键靶标，鉴定了325个ELF3依赖的标记基因。这些基因在表达BdELF3或过度表达ELF4的背景中温度响应性较差。研究人员观察到PolyQ序列对ELF3依赖基因的表达有轻微的影响，这与这些品系的下胚轴长度表型一致。研究人员发现112个基因与最强的ELF3染色质免疫沉淀测序(ChIP-seq)峰相关，其中25个与325个ELF3依赖基因有共同之处，这与ELF3依赖是一种直接机制一致。ELF3直接结合的基因在表达中表现出明显的温度响应性，当ELF3结合稳定时，这一点会受到影响。

为了研究温度是否直接控制ELF3的活性，研究人员分析了自然表达的ELF3与绿色荧光蛋白(GFP)在植物中的行为。在17 °C时，ELF3-GFP为弥漫的核信号。在35 °C时，形成多个亮斑-这是PrD特有的行为，因为嵌合ELF3与BdPrD在很大程度上仍然是弥漫的信号，以响应更高的温度(图2a)。在27 °C时也观察到了这一现象(图2b)。增加PolyQ序列长度也会导致更明显的形成斑点的趋势。

由于植物中的ELF3可能受到其他控制其活性因素的影响，研究人员试图确定ELF3在酿酒酵母，一个缺乏ELF3相关基因的异源系统中的表达是否对温度敏感。在低表达系统下，ELF3-GFP在酵母细胞中形成一个很大程度上弥散的信号；当高表达时，它会形成明亮的斑点 (图2c)。接下来，研究人员研究了温度对酵母中ELF3-GFP的影响。在19 °C时，信号大部分是漫反射的。将细胞移至35 °C会迅速形成尖锐的点状绿色荧光蛋白信号；这种现象在ELF3-Q7和Q35蛋白中比ELF3-BdPrD或游离绿色荧光蛋白更显著(图2d，e)。这些影响似乎是ELF3所特有的，因为35 °C低于内源蛋白质聚集所需的温度，研究人员在这些条件下观察到强劲的细胞生长和蛋白质表达。虽然经典的朊病毒与细胞中稳定的不溶性聚集体有关，但夜间复合体和ELF3经历了每天的活动周期，温度在短时间尺度上波动，这表明温度响应的可逆性是很重要的。事实上，当植物从27 °C转移到22 °C时，夜间复合体迅速恢复所有活性，并且将酵母细胞从35 °C返回到19 °C会导致斑点数量迅速减少(图2f，g)。

图2 高温诱导体内ELF3斑点形成。a，用7个重复PolyQ序列(ELF3-Q7)或由B.disachyon ELF3的相应区域替换PrD的嵌合ELF3 (ELF3-BdPrD)表达绿色荧光蛋白标记的ELF3的荧光图像。b，与a中的幼苗一样，但从两个独立的实验中移动到27 °C。c，将来自着丝粒质粒(Low)或上体质粒(High)的绿色荧光蛋白标记的ELF3(Q7)的酵母细胞在30 °C的选择性合成完整培养基中培养，以获得低水平或高水平的蛋白表达。d，将表达绿色荧光蛋白的酿酒酵母细胞中的ELF3斑点与ELF3融合(Q7)、具有较长PolyQ重复序列的ELF3 (Q35)、或ELF3与B.disachyon (BdPrD)的PrD融合，在19°C下过夜生长，并在指定温度下孵育30min，对表达绿色荧光蛋白的酿酒酵母细胞中的ELF3斑点进行定量测定。e，19 °C和35 °C时来自d的细胞图像。f，表达ELF3的酿酒酵母细胞在19 °C培养过夜，在35 °C孵育30分钟，然后移位到19 °C培养60分钟。g，f中细胞的ELF_3斑点的量化。

3 ELF3的PrD对温度的响应经历了可逆的相变

这些结果表明ELF3能够采用两种构象：一种是活性的可溶性形式，另一种是在温度较高时可见的高阶多聚体形式，表现为明亮的斑点。有人提出，朊病毒类蛋白的一个主要生物学功能是充当环境开关，因为它们能够迅速改变构象并形成液滴。由于ELF3在体外很大程度上是不溶的，研究人员构建了一个跨越PrD的肽段，研究人员发现它是可溶的(ELF3PrD)。与BdELF3PrD不同，拟南芥ELF3PrD受到离子强度、蛋白质浓度和温度的控制，迅速和可逆地形成液滴(图3a，b)。

为了分析这种行为的动力学，研究人员纯化了ELF3PrD与GFP融合(PrD-GFP)。降低盐浓度和pH会诱导PrD-GFP发生相变，形成微米级的球形液滴。液滴在溶液中具有高度的流动性，并能够熔化，这表明是相分离的液体(图3c)。使用光褪色后荧光恢复(FRAP)，研究人员发现恢复比例从0.1到0.8不等，恢复半衰期从几秒到几分钟不等(图3d)。为了确定PrD是否具有温度响应性，研究人员分析了液滴形成与温度的关系。纯化的ELF3PrD多肽在低温下更易溶，但在温度变化后经历了急剧的相变，中点为28.7±11.8 °C(图3e)。当温度降低时，这个过程在很大程度上是可逆的，这个循环可以重复(图3f)。这一发现与拟南芥幼苗ELF3系统的温度响应一致，在27 °C观察到最强的表型效应。这一反应是PrD所特有的：BdELF3的等价肽片段没有液滴形成(图3e)。

图3 ELF3的PrD随温度发生可逆相变。a，纯化的ELF3PrD多肽在体外形成液滴。b，来自BdELF3的等效蛋白结构域，据预测不包含PrD，保持可溶性，不显示任何液滴形成。c，纯化的ELF3PrD-GFP蛋白在体外形成球形液滴，融合在一起。d，ELF3PrD-GFP液滴在光褪色后恢复较快。e，ELF3PrD、BdELF3和单独缓冲液的光散射随温度的变化。f，ELF3PrD的光散射随温度变化的可逆性。

结论

这些结果表明ELF3的PrD是一种可调谐的热敏传感器。本质上无序的蛋白质经常表现出温度响应性的液-液相分离，这一行为是由溶剂介导的相互作用，并以一种依赖于序列的方式驱动。由于PrD和本质上无序的蛋白质序列在真核生物中广泛存在，分析它们是否被其他环境信号中的相变来招募并提供热响应将是有意义的。

评论

朊病毒（prion）实质是一类具有感染性的特殊蛋白，朊病毒（SC型PrP型蛋白）接触到了生物体内正常的C型PrP蛋白，导致C型蛋白变成了SC型，通过蛋白变构来批量复制自己。所以，朊病毒依然是由基因编码的，通过改变正常PrP蛋白的构象来实现自我复制和传播疾病。本研究发现朊病毒结构域中polyQ重复序列的长度与热响应性相关。该研究显示，来自热带植物中的ELF3蛋白，没有可检测的PrD，在高温下具有活性，并且缺乏热响应性。ELF3的温度敏感性也受ELF4的水平调节，表明ELF4可以稳定ELF3的功能。在拟南芥和异源系统中，与绿色荧光蛋白融合的ELF3以较高的温度在数分钟内以PrD依赖的方式形成斑点。响应于体外温度升高，包含ELF3 PrD的纯化片段可逆地形成液滴，表明这些特性反映了PrD赋予的直接生物物理响应。温度通过相变使ELF3在活动状态和非活动状态之间快速转换的能力代表了以前未知的热敏机制。

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