科研 | Nucleic Acids Research：空间多重RNA原位杂交揭示肿瘤的异质性
编译：不二，编辑：十九、江舜尧。
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基因表达模式分析的多重RNA原位杂交在研究发育和疾病中起着重要作用。本研究展示了一种多重RNA-ISH检测组织切片中肿瘤空间异质性的方法。作者利用微流体芯片在数十分钟的时间内将ISH探针局部递送到几百微米的区域中。这种空间多重的方法可以与基于信号放大的ISH方法、明场检测以及福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）的组织切片相结合。通过使用这种方法，作者在单个乳腺癌切片上以空间多重的方式分析了带有阳性和阴性对照（ActB，dapB）以及预测性生物标志物组（ER，PgR）的HER2的表达。进一步证明了该技术在乳腺癌亚型分化中的适用性。HER2的局部分析显示，在测试模棱两可的肿瘤样本中，基因表达显示出中度到高度空间异质性（Cohen效应量r=0.4）。因此，作者举例说明了使用这种互补方法进行空间异质性分析的重要性，特别是对于测试模棱两可的肿瘤样本。由于该方法与多种ISH方法和组织样品兼容，因此有可能在人类疾病分子分析中找到广泛的适用性。
论文ID
原名：Spatially multiplexed RNA in situ hybridization to reveal tumor heterogeneity
译名：空间多重RNA原位杂交揭示了肿瘤的异质性
期刊：Nucleic Acids Research
IF：11.147
发表时间：2019.12
通讯作者：Govind V. Kaigala
通讯作者单位：瑞士IBM研究中心
DOI号：10.1093/nar/gkz1151
实验设计
本研究以MCF7、SKBR3和BT474细胞系以及乳腺癌组织作为实验材料，利用微流体芯片开发空间多重RNA原位杂交的方法，进行ActB、dapB、ER、PgR和HER2的表达分析，结果使用免疫组织化学进行验证。
研究内容
微流体实现局部RNA-ISH
肿瘤组织的分子异质性反映了基因表达的空间差异。为了在转录本水平上研究这些差异，作者开发了RNA-ISH分析的微流体实验（图1A）。通过使用基于扩增的转录本检测，可以在单个组织切片上增加研究的转录本数量。理论上说，可以在10mm×10mm的组织区域上进行多达3000次杂交反应。但是，实际上可以执行的反应数量取决于多种因素，从组织的形态到探针的可用性以及微流体芯片的设计。
在整个组织玻片上进行肿瘤组织切片的预处理，包括去除石蜡、热介导的预处理和蛋白酶消化。需要精确控制预处理步骤，特别是蛋白酶对原始组织的消化时间。对于后续探针的递送，作者使用了开放空间的微流体芯片。通过同时注入和抽取探针溶液，将其递送至约50-100个细胞切片（直径约150µm）的空间区域。因此，可以在同一肿瘤区域内的相邻区域中使用感兴趣的多种转录本的探针。另外，通过使用分层流动限制，可以使用不同的探针靶向区域内部和外部，从而可以产生局部递送的模式。即使在流量恒定的情况下，RNA-ISH信号的探针递送时间也从10分钟增加到60分钟。然而，进一步增加了探针的杂交时间，但是并没有增加信号强度。因此，使用微流体芯片时，选择60分钟的孵育时间。流动条件下不断输送探针导致对流时间缩短，杂交时间缩短，这有利于按顺序递送多个探针，而又不影响完整工作流程所需的时间（11-14小时，具体取决于空间多重和光谱多重条件）。随后在整个肿瘤组织切片上进行信号放大和可视化，从而可以直接比较每个肿瘤组织切片内的信号，而不必考虑荧光基团和检测光学器件的其他特性。
因此，微流体芯片系统的使用允许许多不同RNA多重空间靶标。用于信号和酶底物扩增的寡核苷酸的整体递送可以在单个反应中同时扩增和可视化不同的靶标，从而促进了不依赖于扩增过程的定量比较。
图1 局部RNA原位杂交。
具有阳性和阴性对照的生物标志物分析
将微流体芯片用于空间确定的RNA-ISH实验，可以在单个组织切片上按顺序或同时递送多个靶向RNA序列的探针。作者在同一张载玻片上加入了dapB探针（枯草芽孢杆菌，阴性对照）、肌动蛋白β（ActB，阳性对照）以及感兴趣的生物标记物HER2的探针。阳性对照可作为RNA完整性的指标，而阴性对照（未在人体组织中表达）可提供酶促反应有关背景、扩增探针的非特异性结合和染色的信息。在局部递送区域中dapB信号的缺乏和在空间限定区域周围的细胞中ISH信号的缺乏用作阴性对照。图1B显示了MCF7、SKBR3和BT474细胞系的FFPE切片，在该切片的空间区域具有dapB、HER2和ActB的RNA-ISH信号。信号强度的相对定量是基于每个细胞切片的FISH信号的平均积分强度。组织切片内表达水平的相对比较不依赖于扩增、酶促可视化反应和成像条件，因为它们对于同一切片中所有转录本是相同的。因此，直接在单个组织切片中比较基于ISH信号强度的表达水平。在所有三个细胞系中都检测到了阳性对照ActB的信号，每个细胞的平均积分强度在40到100之间，而dapB信号在所有样本中都很低（平均积分强度为3-10）（图1B，2）。HER2的信号强度在这三个细胞系之间显示出强烈的变化，其中SKBR3每个细胞的平均积分强度为438，BT474每个细胞的平均积分强度为208，MCF7的信号强度较弱（int=7）。这与使用免疫组织化学检测到的这些细胞系的表达水平一致，其中SKBR3和BT474定义为HER2（3+），而MCF7定义为HER2（0-1+）。该方法能够估计已知乳腺癌细胞系中的HER2过表达。因此，作者应用相同的方法研究了乳腺癌切片中HER2的表达，发现在分析的肿瘤区域中，与阳性对照ActB相比，HER2强烈表达（图2A）。因此，所分析的肿瘤是HER2阳性的。
使用这种方法，与看家基因（如ActB）的比较可用于定量目的基因表达水平的差异。作者根据每个细胞切片的平均积分强度计算了HER2和ActB表达水平的比率。对于MCF7细胞，计算得出的比率为0.07。BT474细胞和SKBR3细胞分别是5.65和6.64。研究的乳腺癌切片显示其表达比率为23。然而，基于ISH信号的积分强度，作者观察到ActB的表达水平在乳腺癌细胞系MCF7、SKBR3和BT474之间有所不同（图2B）。因此，在基于看家基因ActB进行定量时，不同细胞系之间的直接比较必须仔细考虑。尽管确实可以比较某个细胞系的不同细胞周期状态，但应考虑使用其他看家基因来比较不同细胞系或肿瘤组织。
本研究证明了可以使用基于微流体芯片的ISH探针以多重方式分析目标转录本。但是，用于转录水平相对定量的看家基因必须仔细评估。将阴性和阳性对照整合到实验中可提供针对非特异性信号的措施，并确保分析前和分析条件（例如固定，组织预处理，测定参数）不会影响RNA完整性。因此，该方法为受控基因表达分析提供了坚实的基础。
图2 使用阳性和阴性对照的RNA原位杂交检测HER2表达状态。
预测性乳腺癌生物标志物组的RNA-ISH多重分析
空间多重的RNA-ISH使用单色检测对生物标志物进行分析。作者将分析重点放在了预测性乳腺癌生物标志物组雌激素受体（ER）、孕激素受体（PgR）和HER2上。通过使用基于微流体芯片的局部递送，我们确定了它们在乳腺癌细胞系和乳腺癌细胞切片中的表达水平（图3）。成像条件保持不变，分析图3中的不同细胞系和癌组织。观察到MCF7细胞（int=29）中ER表达升高，MCF7和BT474细胞（分别为int=16和int= 535）中PgR表达升高。HER2在SKBR3细胞（int=1057）和BT474细胞（int=836）中强烈表达，在MCF7（int=20）中轻度表达。乳腺癌切片显示HER2过表达，而ER和PgR信号未升高（图3）。这些结果与免疫组织化学分析的结果一致。在MCF7细胞中，ER和PgR的Allred得分为6，而HER2的表达量化为0–1+。另一方面，SKBR3细胞显示HER2（3+）的高表达，而ER和PgR（Allred得分=0）没有过表达，而BT474细胞表现出HER2（3+）和PgR（Allred得分=8）高表达。
这些结果显示了多种转录本的多重分析。通过在荧光或明场检测模式下使用单色RNA-ISH，可以实现生物标志物组检测。这有助于同时定量多个转录本，并允许在单个组织切片或少量有价值的组织进行大量转录本检测。
使用两个空间位置，可以可视化生物标志物组ER/PgR/HER2和阳性对照ActB以及阴性对照的基因表达模式。ActB和HER2使用Fast Red可视化，ER和PgR使用Fast Blue可视化。ActB信号和探针局部递送周围的区域显示出切片中RNA的完整性，以及由于非特异性反应而可忽略的信号。如预期的那样，MCF7细胞显示ER和PgR的过表达，而HER2信号明显低于其他细胞系。另一方面，SKBR3细胞和BT474细胞以及癌组织切片显示出很强的HER2信号。PgR在BT474细胞切片中显著过表达。这与这些细胞系亚型分化为腔A、腔B和HER2过表达相一致，BT474细胞的PgR的Allred得分为8，而MCF7细胞的PgR的Allred得分为6。
尽管在使用荧光激发和检测时灵敏度更高，但是当在单个组织切片上使用明场显微镜时，空间方多重方法可以检测多种不同类型的转录本。通过使用微米大小的杂交区域，理论上可以通过空间多重在单个组织切片上检测到数千个转录本。另外采用双色检测方案，可以将不同类型检测到的转录本数量加倍。
图3 用于检测乳腺癌生物标志物的单色多重RNA-ISH。
用于检测分子肿瘤异质性的空间多重RNA-ISH
多重RNA-ISH检测方法可同时对多个生物标志物进行空间分析，包括阳性和阴性对照（图2）或生物标志物组（图3），作者应用该技术研究了转录本表达水平的空间异质性。通过全局或局部应用的RNA-ISH，作者分析了乳腺癌组织中HER2表达的空间异质性（图4）。每个肿瘤区域（5mm至1cm区域之间的距离，由纤维组织隔开）由该区域内的多个位置（距离为几百µm的区域）表示。分析了每个区域内的差异（区域内差异）以及不同区域之间的差异（区域间差异）。使用Mann-Whitney检验和Cohen效应量分析了区域内和区域间表达水平的差异。对于强烈表达HER2的癌组织（35个HER2拷贝，HER2 IHC 3+），区域间异质性较弱，Cohen效应量范围为r=0.09至0.11（图4B）。区域2和3中的区域内差异很小，而区域1显示HER2表达水平的异质性略有增加（图4B）。具有较低HER2蛋白表达状态（5个HER2拷贝，HER2 IHC 2+）的癌切片显示区域2和3之间的区域间异质性较弱（r=0.04），并且将它们与区域1进行比较时HER2表达水平存在中等至强烈差异（对于区域1和2以及区域1和3，分别为r=0.36和r=0.34）（图4C）。此外，区域1的区域内异质性中等，区域内不同区域之间的效应量范围为r=0.05至0.4。这些结果表明HER2的分子异质性在肿瘤和患者之间是不同的。虽然一些肿瘤显示出HER2表达水平的均匀分布，但其他肿瘤则显示出中等到较大的差异。组织切片的组织学和病理学评估与使用RNA-ISH观察到的HER2表达模式相对应。高度表达HER2的组织切片（图4B）包含35个HER2基因拷贝，使用免疫组织化学法分类为HER2 3+，而表达低HER2的癌组织带有5个HER2基因拷贝，HER2得分为2+。该肿瘤组织的评价是模棱两可的。有趣的是，这些模棱两可的结果对应于在HER2转录水平上具有中等至高度空间异质性的组织，这表明分子肿瘤异质性对于将乳腺癌分化为亚型非常重要。
多重分析揭示了与ActB表达水平相关的HER2基因表达的异质性（图5A）。虽然在组织的三个不同区域之间检测到ActB表达的变化很小（r=0.08-0.21），但与其他两个区域相比，区域3中HER2的水平显著降低（区域1和3之间以及区域2和3之间的比较，两个都是r=0.74）。这表明了HER2的差异调节，而区域之间的总RNA含量是恒定的。HER2/ActB表达比率的比较显示，区域3中HER2的表达比所分析的其他两个区域低15倍，HER2/ActB（区域1）=0.7，HER2/ActB（区域2）=0.6，HER2/ActB（区域3）=0.04。
图4 空间多重RNA-ISH检测乳腺癌组织中空间肿瘤异质性。
转录本与蛋白质表达之间的相关性
作者进一步研究了转录本和蛋白质水平表达差异之间的相关性。在免疫组织化学结果中，鉴定了HER2状态为3+的癌组织切片的HER2表达水平及其区域内和区域间差异（图5B和C）。使用标准免疫组织化学和定量免疫组织化学（图5B和D）分析HER2蛋白水平。在所分析的四个区域之间，HER2基因表达的异质性在区域1、2和4之间显示出较小的效应量。将这些区域与区域3进行比较时适度（区域1和3以及区域4和3的r=0.26，区域2和3的r=0.19）。相应地，与其他区域相比，HER2蛋白在区域3中显示出更高的表达（图5C）。显然，作者观察到了转录本和蛋白质水平之间HER2的空间异质性。
总之，空间多重的RNA-ISH可用于检测多个生物标志物的空间分子肿瘤异质性，或与看家基因和内部对照结合使用。转录水平可以提供关于基因表达状态的额外的定量信息，并且可以与现有方法互补的方式用于生物标志物分析，这对于模棱两可的肿瘤病例特别有利。
图5 乳腺癌切片中HER2基因的差异表达。
讨论
空间肿瘤异质性是肿瘤进展和耐药性发展的重要动力，在临床决策中很少考虑。因此，需要一种描述分子肿瘤异质性的可行方法。目前有很多在蛋白质和转录本表达水平上研究空间细胞异质性的方法。多重免疫组织化学可以在空间上检测多达16种不同的蛋白质。近期的研究还探索了使用红外成像或组织学图像深度学习的方法对生物标志物进行无标记检测。此外，最新开发的许多用于转录本空间分析的新技术。它们的范围包含从单细胞测序数据的位置推断或激光捕获显微切割切片的二代测序到原位测序或模式化微阵列。每种方法都有其自身的优势，例如可检测到的不同转录本的数量、检测效率或基因表达的定量。但是，这些方法中的许多方法都需要使用活细胞或新鲜的冷冻组织来确保RNA的稳定质量。由于FFPE样品是病理实验室和组织生物库中最常见的样品类型之一，可以在福尔马林固定的样本中检测基因表达水平的方法会非常有利，并可以使该技术向其他实验室的转化。为了限制技术复杂性并使空间转录本分析用于临床，作者开发了一种用于RNA-ISH多重化的新方法，该方法已被证明与FFPE组织兼容。RNA-ISH提供了检测低表达水平的转录本（例如非编码RNA）的其他优势。该方法基于使用扩增和明场或单色荧光检测RNA的方案。作者利用微流体芯片来精确、局部地递送ISH探针到FFPE切片上，并通过简单的方案实现空间多重检测。
通过使用空间多重的方法可以增加基于扩增的RNA-ISH技术的不同靶标数量。当前用于ISH的非荧光和基于酶的扩增方法具有消除对高灵敏度检测光学器件需求的优势。但是，它们仅限于两个不同的目标样本。通过应用空间多重的方法，可以缩小不同靶标的数量。并且该方法可以直接比较切片内的信号强度，而无需控制预处理条件的变化或扩增反应。由于可以使用单色进行多重分析，因此不必校正量子产率、激发功率以及激发和发射滤波器带宽的差异。此外，在评估高度表达的基因时，转录本的光谱多重分析可能是有利的，因为密集的分布阻碍了与多个靶标的杂交。
通过检测带有组织阳性和阴性对照的HER2转录本，在单个肿瘤组织切片中对预测性乳腺癌生物标志物组ER/PgR/HER2进行分析，证明了该技术的实用性。在临床决策中，对照反应非常重要，因为它们可提供有关组织加工条件、分子含量的完整性和分析检测性能的信息。内部对照是最精确的测量方法，因此在连续的组织切片或其他样品上优于外部对照。在RNA-ISH中包括内部对照有助于评估RNA完整性和实验条件的稳定性，是测试性能的重要指标。
通过结合RNA-ISH和免疫组织化学，探针和抗体的局部递送将促进在单个组织切片上对RNA和蛋白质的多模式检测。已有的研究表明，可以在单层细胞或组织切片上同时检测转录本和蛋白质，而最近的技术将RNA-ISH和免疫荧光与质谱相结合。此外，微流体芯片可用于同时局部递送原位检测试剂（例如杂交探针，抗体）和局部去除细胞以进行遗传或转录组分析。因此，它可以提供有关整个基因组、转录组甚至蛋白质组的空间信息的能力。以空间多重的方式对转录本和蛋白质进行定量分析，对于阐明肿瘤的发生和发展具有广阔的前景。肿瘤活检的未来研究可以提供该技术在临床上适用性信息。
评论
总而言之，本研究提供了一种使用单色或明场对转录本进行多重原位检测的通用方法。该方法可以恢复空间信息，这为研究动态过程、细胞谱系的发展以及组织结构在发育和疾病中的变化提供了可能性，因此研究者相信该技术将来可以应用在各种生物学和医学环境中。
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