科研 | Cell：单细胞分析揭示了骨髓靶向治疗结肠癌的机制
编译：小北，编辑：夏甘草、江舜尧。
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论文ID
原名：Single-Cell Analyses Inform Mechanisms of Myeloid-Targeted Therapies in Colon Cancer
译名：单细胞分析揭示了骨髓靶向治疗结肠癌的机制
期刊：Cell
影响因子：36.216
发表时间：2020.4.16
作者： 张泽明
单位： 清华大学
DOI：10.1016/j.cell.2020.03.048.
前言
免疫检测点封闭（ICB）能够通过肿瘤细胞破坏免疫监视并且改变肿瘤处理。然而ICB仅存在于特种癌症的少数病人中，其他的治疗策略来加强抗肿瘤的免疫性已经提出，包括在肿瘤微环境（TME）中敲除促癌因子或者免疫抑制细胞、利用激动剂抗体活化特异的免疫细胞群体。不幸的是，研究者对TME的复杂性并未了解全面，使得这些研究大都是在临床上而不是在已有的机制假说基础上。
单细胞RNA测序（scRNA-seq）是剖析实体瘤复杂性的有力技术，其能够详细的描述细胞的多样性和异质性的表型。在人类原发性肿瘤中基于转录组分析的scRNA-seq不仅能够揭示T细胞的异质性，同样能通过转录组联合分析阐释T细胞群体与T细胞受体之间的动态关系。在之前的研究中研究者确定了BHLHE40+ Th1样细胞群体在结肠癌（CRC）肿瘤样本中显著富集，同时伴随有高的微卫星不稳定性（MSI）。由于仅MSI患者应答于ICB，这些发现提示提高这些T细胞的功能有望促进ICB应答。
近期单细胞方法揭示了肿瘤渗透髓细胞的复杂性，包括多种肿瘤类型中与肿瘤相关的巨噬细胞（TAMs）和树突状细胞（DCs）。TAMs是一类异质性的细胞，其能产生肿瘤和血管生成生长因子、细胞外基质重塑、免疫抑制等促进肿瘤的发生发展。靶向抑制TAM生物活动的免疫疗法已经应用于临床，包括通过封闭CSF1R和其配体CSF1和IL-34相互作用破坏巨噬细胞的扩增与分化，最小的单一抗肿瘤的疗效已经观察到。
肿瘤相关的DCs构成了肿瘤中髓性细胞的一小部分，但是在抗肿瘤的T细胞应答中发挥关键作用。经典的DCs(cDCs)基于不同的表型标记物或者功能被分为两个亚群(cDC1和cDC2)。然而cDC2s在肿瘤中的作用尚不明确，cDC1s能够将肿瘤相关的抗原传递至CD8+T细胞，在抗肿瘤T细胞应答产生中发挥重要作用。提高DCs功能的多个策略已经应用到临床，活化CD40的方法已经被广泛应用。然而与CSF1R抑制剂相同，CD40激动剂单一的疗效有限。研究者致力于开发这些靶向髓性细胞的疗法依赖于对实体瘤中髓性细胞异质性的全面了解，以及在TME中免疫细胞的功能和相互交流对治疗的影响。
结果
通过结合基于平板和液滴的scRNA-seq确定人类CRC中肿瘤细胞类型
研究者首先通过FACS从肿瘤细胞中分选出CD45+和CD45-细胞（表1）。经过基于液滴的基因组平台或者基于平板的全长Smart-seq2平台进行scRNA-seq获取单个细胞的转录组（图S1A）。将获取的数据与之前同类型病人样本中T细胞的全长转录组结合（图S1A）。经过质控和过滤共获得43,817 (10×scRNA-seq)和10,468 (Smart-seq2)单细胞转录组(STAR)。如期望的一样，Smart-seq2平台可捕获更多的基因，包括细胞因子，CD分子、配体/受体以及转录因子，与10×scRNA-seq 平台相比表现出较弱的分批效应（图S1B–S1F）。
为了确定肿瘤渗透淋巴细胞的主要群体和亚群结构，研究者在这两个数据组中分别做了聚类分析，确定了主要的免疫细胞类型，包括髓性细胞、先天性淋巴样细胞(ILCs)、T细胞和B细胞（图S2A）。进一步的无监督聚类分别从10×scRNA-seq和Smart-seq2两个组别中获取38和36个淋巴细胞集簇（图1A）。研究者利用推理回归模型确定了两个组别中集簇的相似性和关联（图S2E）。淋巴细胞集簇表现高度相似性的定义为同一细胞集簇，残留的依据它们特异的基因特征进行人为注释。两个平台间的淋巴细胞。肿瘤相关的胞浆B细胞、肠相关的淋巴组织B细胞、囊泡B细胞和生发中心B细胞高度相似，并且可以依据不同的免疫球蛋白重链特征进行区别（图S2F）。同样，两个平台都能捕获ILCs，包括血液和组织中富集的NK细胞、在正常粘膜中富集的ILC3细胞（图S2B和S2C）以及肿瘤富集的组织上的NK细胞(hI03)，hI03对抑制型受体、细胞毒性分子以及细胞增殖相关基因的表达与CD8+疲劳的T细胞相似（图S2G）。与淋巴细胞不同，髓性细胞在这两个平台中表现出更大的分歧。特别是，两个中间物状态单核细胞亚群（hM07和hM11）主要被10×平台捕获（图1B），这也提示每个病人中测序的大量细胞需要确定稀少的或者转变中的细胞群体。最终，研究者从这两个平台中捕获了13个髓性细胞集簇、4个ILC集簇、18个T细胞集簇以及5个B细胞集簇，这一结果与不同癌症scRNA-seq的结果大部分吻合。所有的细胞集簇通过t-SNE分析可视化（图1C、S3A）。每个集簇由多个不同病人中的细胞组成并且与不同组织分布图谱相关（图S3B、S3C）。
对于Smart-seq2平台捕获的非免疫细胞，聚类分析发现有12个细胞集簇（图S3D）。由拷贝数变异定义的肿瘤细胞在基因表达上具有更高的异质性，因此形成了病人特异的集簇（图S3E、S3F）。与之前在CRC中的报道一致，研究者在正常粘膜和肿瘤中确定了几个非癌细胞集簇，包括血管内皮细胞、四组上皮细胞（肠上皮细胞、干细胞样细胞以及两组杯状细胞）、两组成纤维细胞。重要的是与正常粘膜相比，成肌纤维细胞和癌症相关的成纤维细胞（CAFs）更易在CRC肿瘤中发现（图S3G、S3H）。
综上，Smart-seq2平台能够捕获更多的基因、对调节的信号通路能够允许有一个更大的测序深度（图S1），10×测序平台能够有效的获得更多的集簇（图1B）。Smart-seq2的基因深度与10×scRNA-seq的细胞覆盖能够使细胞类型或者稀少群体最大化，并且提高细胞集簇的结果。因此，研究者权衡两个测序平台的优势来定义肿瘤渗透髓性细胞的特定及其在CRC中与其他细胞之间的相互作用。
单核细胞/巨噬细胞亚群具有组织特异性
研究者首先从13个髓性细胞亚群中剖析了基因特征（图2A-2C、S4A-S4B、表S2）。在这些集簇中，肥大细胞（hM01）能够表达一组特异的基因，例如TPSAB1/2、CPA3、MS4A2、KIT（图2B），与肺癌相反，在肿瘤和正常的粘膜中相对富集（图2C），这与在CRC中肠道细菌的内稳态以及炎症调节一致。
三个DC集簇(hM02-hM04)、浆细胞样的DC (pDC)、cDC2以及cDC1细胞，其特征是HLA-DRs的高表达和CD14的低表达（图S4B、S4C），并进一步的由LILRA4/LILRB4、CD1C/FCER1A、XCR1/BATF3的特异性表达区分（图2B）。这些DCs在CRC肿瘤和正常的粘膜中富集（图2C）。三个血液中富集的集簇(hM05-hM07)，其典型特征是经典的CD14hiCD16、非经典的CD14+CD16hi以及一个中间体CD14hiCD16+单核细胞（图S4A、S4B），与之前的报道大致一致。
剩余的集簇依据CD68、CD163、MRC1的表达被确认为巨噬细胞。在正常粘膜与病毒比较中组织上的巨噬细胞（RTMs）证实hM08相对富集，hM09和hM10更易富集，而组织上富集的集簇由TAMs(hM12-hM13)注释（图2C）。促炎症细胞活素基因IL1B在所有RTM群体中均表达，而NLRP3+ RTMs表达最高（图2D），这与NLRP3在炎症组中激活IL-1b并且调节肠稳态扮演的角色是一致的。NLRP3+和PLTP+的RTMs与IL1B+ RTMs相比都表达较低水平的HLA-DR，而PLTP+ RTMs特异的表达LYVE1、IL10（图2D），这与近期的报道Lyve1hiMHCIIlo单核细胞衍生的RTMs大部分坐落在血管上，具有限制炎症和纤维化的作用。
TAMs主要由肿瘤渗透单核细胞样前体发育而来
近期在小鼠中的研究发现TAMs能够从RTMs以及新募集的单核细胞逐步分化成巨噬细胞中产生。利用嵌在扩散图谱上的RNA速度分析预测细胞的命运，发现从CD14表达的单核细胞到FCN1+样单核细胞具有强烈的方向流以及不同的巨噬细胞群体（图2E）。显著的是，肿瘤富集的FCN1+单核样细胞与血液CD14+单核细胞高度相似，更表现出转移进入肿瘤并且具有肿瘤特异转录程序的单核细胞亚群（图S4D）。
两个正交算法URD和PAGA进一步解释了巨噬细胞的转录轨迹，提示FCN1+单核样细胞能够通过不同的RTMs引起C1QC+ 和SPP1+ TAM亚群（图2F、S4E）。有趣的是，C1QC+ TAMs能够与IL1B+ RTMs相连，并且两个集簇能够表达C1Q补充成分以及HLA-DR。重要的是，与C1QC+ TAMs 相比，IL1B+ RTMs表达低水平的APOE和APOC1（图2D），这也提示这些细胞与C1QC+ TAMs的功能表型部分相似，但是与肿瘤应答相似的转录程序并未上调。相反，SPP1+ TAMs主要与NLRP3+ RTMs相关，两个集簇都表达低水平的HLA-DRs。的确，NLRP3+RTMs部分仍然在肿瘤内出现（图2C），这也提示在TME中与SPP1+ TAMs 相反。综上，C1QC+和SPP1+ TAMs都是从肿瘤渗透单核样细胞前体中发育而来，SPP1+ TAMs 可能由NLRP3+ RTMs衍生而来（图S4F）。另外，体外正常或者缺氧条件下进行分化实验，在细胞因子或者生长因子存在下，结果发现CD14+单核细胞在TAM群体差异表达（图S3A），IL-1b和VEGF家族成员能够在缺氧条件下上调SPP1+ TAMs标记物MARCO的表达（图S4G），这与研究者的假说是一致的：TME能够促进TAM群体的发育。然而，在肿瘤和正常组织中全面揭示复杂的巨噬细胞的发育轨迹需要体外细胞分化和体内线性轨迹的额外研究。
人类CRC中TAMs的二分功能表型
与乳腺癌和肺癌中的TAMs在TME中表现连续范围的表型相反，在CRC中的TAMs具有显著的二分（图2F）这也提示在细胞内存在分化的信号通路。重要的是，在两者的TAMs中表达不同的转录因子，包括C1QC+ TAMs中的MAF/MAFB 和FOS/JUN、在SPP1+ TAMs中的CEBPB和ZEB2 (图S4H)，这与TAMs两个亚群受转录稳定调控的发育和功能一致。在TAMs中与“经典活化（M1）”和“选择性活化（M2）”相关的基因表达分析并不能解释CRC中确定的C1QC+ TAM和SPP1+ TAM的二分（图S4I）。
研究者进一步比较了TAM群体中差异表达的基因发现C1QC+ TAMs能够高表达补充C1Q的基因TREM2、MERTK、CD80（图3A），而SPP1+ TAMs能够特异性的表达SPP1、MARCO、VEGFA（图3A）。在两个TAM群体中利用GSVA评估了已知的信号通路表达发现SPP1+ TAMs在肿瘤血管生成、ECM受体相互作用以及肿瘤脉管系统信号通路富集，而C1QC+ TAMs在补体激活、抗原的加工呈递信号通路富集（图3B）。显著的是，SPP1+ TAMs还表现出在结直肠腺瘤和转移的肝癌中特异性富集（图3B、3C），这也提示在CRC中促肿瘤生成和促转移的作用。多色成像的数据分别通过共表达CD68、CD80、MAF或者CD68、MARCO、VEGFA也证实了TAMs两个亚群的存在（图3D）。此外只有C1QC+ TAMs在溃疡性结肠炎（UC）和正常个体中结肠粘膜中被确认，而在SPP1+ TAMs在非癌组织中大量缺失（图S4J、S4K），这提示在CRC的TME中二分的功能表型。
TAM和cDC亚群构成了细胞与细胞相互作用的中心
为了分析CRC整体的细胞与细胞之间相互作用，研究者通过结合scRNA-seq和TCGA中bulkRNA-seq的数据进行了计算模型分析，除了确定了与特定集簇高度相关的基因，研究者也将TCGA数据库中高度相关的基因与scRNA-seq集簇进行比对，确定了共同发生的特异细胞类型（图S5B）。通过利用计算机模型到所有在肿瘤中富集的细胞亚群，研究者建立了CRC中细胞与细胞相互作用网格。利用GTEx中正常组织的数据库研究者进行了同样的分析（图S5C）。这些分析确定了肿瘤中成纤维细胞和内皮细胞之间已知的相互作用，以及正常粘膜中囊泡B细胞和Tfh细胞之间的相互作用（图3E、S5C），提示在未明确描述的细胞类型的生物学意义。
在邻近正常粘膜中确定了B细胞、T细胞以及DCs之间的相互作用，更易反映出结肠淋巴滤泡之间的交流（图S5C）。相反，在肿瘤细胞中确定了不同的相互作用，TAMs和cDCs作为相互作用网络的中心，供给与其他细胞类型中的相互作用（图3E）。SPP1+ TAMs表现出与CAFs和成肌纤维细胞之间的相互作用，C1QC+ TAMs和两组cDCs主要与其他的免疫细胞特别是T细胞亚群相互作用（图3E），提示其在调节抗肿瘤T细胞应答中的功能。
为了进一步揭示调节细胞与细胞相互作用的分子网络，研究者计算了scRNA-seq数据中配体-受体对的吸引力并且模拟分析确定了展示显著的细胞群体特异性的数以百计的相互作用对。关于髓性细胞和T细胞的配体-受体对中，CXCL10-CXCR3在C1QC+ TAMs中显著富集，强调了C1QC+ TAMs在招募活化T细胞中的关键作用。与C1QC+ TAMs和其他淋巴细胞相比，SPP1+ TAMs更倾向于表达SDC2，其与CAFs和内皮细胞中高表达的MMP2结合，在多个肿瘤中与细胞生长和转移相关。在SPP1+ TAMs和包括SPP1-ITGAV和FN1-ITGA5的其他细胞亚群相互作用的配体-受体对，与SPP1+ TAMs相互作用的表达高水平的SPP1和FN1（图3F、S5D、S5F）。研究者的分析提示SPP1和FN1可能与某些整联蛋白相互作用促进CRC肿瘤的发生发展。总之，scRNA-seq的数据提示TAMs和cDCs包含细胞与细胞相互作用网络的中心，TAMs可能通过与CRC的TME中不同的免疫细胞和基质细胞相互作用发挥二分的功能。
人类和小鼠中共有的主要肿瘤相关的髓性细胞群体
接下来，研究者通过scRNA-seq研究了小鼠肿瘤模型中不同髓性细胞群体对抗肿瘤免疫应答的效果，并且将这些数据与人类髓性细胞异质性的发现相联系。研究者关注了已经广泛应用于临床的治疗策略：通过CSF1R封闭导致的TAM敲除以及通过CD40激动剂导致的DC活化。研究者首先在多重同源的小鼠肿瘤模型中评估了治疗效果，确定了Renca肿瘤的生长对抗CSF1R封闭的抗体敏感，以及MC38的生长对抗CD40的抗体敏感（图S6A）。基于这些研究，利用10×基因测序平台对从Renca或者MC38肿瘤中分离得到的免疫细胞进行多样的scRNA-seq研究。
利用基于图表的集簇分析在Renca和MC38的scRNA-seq数据组中确定了主要的免疫细胞亚群，包括T细胞和髓性细胞群体（图S6D）。为了更好比较肿瘤相关小鼠髓性细胞亚群与人类中的亚群，研究者将取自两个模型中的髓性细胞进行综合聚类，确定了15个分立的细胞集簇（图3G）。每个集簇都与表示不同细胞类型的特异基因表达谱相关（图S6E），并且每个集簇大都在MC38和Renca肿瘤中确定（确定S6F）。为了确定人类和小鼠群体中的关系，研究者进行了系统的相似性分析，确定了在种系中多样相应的髓性细胞群体（图3H）。
首先看cDC群体，研究者确定了小鼠中两个cDC1亚群(mM06和mM07)（图S6G），两者都能够与人类CRC中单个cDC1集簇(hM04)对应（图3H）。研究者通过再聚类对人类BATF3+ cDC1集簇的异质性进行了评估，发现人类中cDC1细胞的表型（图S6H）。重要的是，这两组cDC1表型与已知cDC1细胞的未成熟活化状态以及最近描述的人类和小鼠肿瘤中活化的LAMP3+CCR7+ DCs相似（图S6I）。研究者在小鼠肿瘤中确定了两个cDC2集簇(mM04和mM05)能够与人类CRC(hM03)中单个cDC2群体对应（图3H）。重要的是，Itgax+ cDC2集簇像代表经典的cDC2亚群，而Cd209a+ cDC2集簇与单核细胞衍生的DCs、可能区别于新渗透的血液中的单核细胞具有相同的特征。
与DC群体相反，TAMs在人类和小鼠间表现出更大程度的表型异质性，与肺癌中近期的发现相同。然而，小鼠巨噬细胞亚群(mM11-mM14)与人类C1QC+ TAMs高度相似并且与人类SPP1+ TAMs的基因表达极少重叠。相反小鼠巨噬细胞集簇mM15_Macro-Vegfa与人类SPP1+ TAMs高度相似（图3H）。利用人类TAM集簇分析的方法对小鼠TAM亚群进行了相似的信号通路分析（图3B），研究者发现小鼠TAM群体以血管生成、缺氧以及T细胞相互作用基因特征为基础也是分开的（图4A）。这些数据提示在人类CRC病人和小鼠肿瘤模型中存在功能类似的TAM群体。
促进血管生成的巨噬细胞群体耐受于对抗CSF1R封闭的治疗
研究者接下来评估了抗CSF1R对小鼠TAM群体的效果并且将这些发现与人类中对应的群体相关联。如所期盼的，Renca肿瘤小鼠经anti-CSF1R处理后TAMs的频率降低（图4B）。然而，检测到的TAMs群体仍然anti-CSF1R处理。对这个anti-CSF1R耐受的群体评估发现高表达F4/80的巨噬细胞显著降低（图S7A-S7D），提示anti-CSF1R处理的不同巨噬细胞群体敏感性差异。与这些发现一致的是，Renca肿瘤的scRNA-seq数据分析发现集簇mM12和mM14完全缺失，但是在anti-CSF1R处理后TAM集簇中的mM11、mM13、mM15少量降低（图4C、4D）。的确，某个集簇的频率在anti-CSF1R处理组中升高（图4D），似乎是由于免疫细胞中巨噬细胞的降低。研究者进一步检测了TAM群体在anti- CSF1R处理后的敏感性差异如何改变TME。研究者发现anti-CSF1R-耐受的TAMs表达的基因参与血管生成例如Vegfa、免疫抑制例如Cd274和Arg1（图4E）。重要的是，经anti-CSF1R处理后肿瘤细胞中残留的巨噬细胞也更易与肿瘤血管相关（图4F），这也提示其在调节血管生成过程中扮演的角色。
鉴于CSF1R信号在控制巨噬细胞内稳态中的作用，研究者进一步评估了是否TAM增殖与anti-CSF1R处理敏感性是否相关。Anti-CSF1R-敏感的群体(mM12, mM14)提高了Mki67的表达并且增殖数高于耐受的群体(mM11、mM13、mM15)（图4E、4G）。重要的是，在人类肿瘤中C1QC+ TAMs的增殖数也高于SPP1+ TAMs（图4H）。这些结果提示在小鼠中，CSF1R封闭也导致细胞周期中巨噬细胞缺失，导致在TAM亚群中这种处理的差异效果。将这些结果推断至人类，CSF1R封闭可能更易使C1QC+ TAM亚群中的一部分缺失，而保留SPP1+ TAMs。为了进一步将小鼠中的发现与人类CRC联系，研究者比较了不同水平C1QC+ TAM和SPP1+ TAM基因特征个体的存活，发现在CRC病人中低水平的C1QC+ TAM和高水平的SPP1+ TAM与较差的预后相关（图4I）。这些发现提示anti-CSF1R处理可能对促肿瘤生长的巨噬细胞群体缺失并不充分，该特性可能使Renca小鼠肿瘤模型和人类癌症病人中anti-CSF1R的单一效果甚微。
Anti-CD40处理cDC1群体导致早期特异性扩增
研究者进一步聚焦于揭示anti-CD40激动剂治疗的机制。MC38肿瘤小鼠进行anti-CD40处理导致细胞生长降低（图S6A），当与PD1封闭结合时效果提高（图5A、5B）。从人类CRC和小鼠MC38肿瘤样本中的scRNA-seq分析发现CD40在多个DC和巨噬细胞亚群中表达，特别是cDC1集簇（图5C、5D）。与这些发现一致，研究者进行的细胞与细胞之间相互作用网络分析发现cDCs与多样的T细胞亚群存在广泛的相互作用（图3E、5E），并且发现CD40LG在人类和小鼠肿瘤中多样的CD4+ T细胞集簇中高表达（图5C、5D）。尽管CD40/CD40LG信号通路调节髓性细胞与T细胞之间的相互作用，研究者进一步确定了更易受CD40激动剂影响的特异的髓性细胞和T细胞。
不同时间点anti-CD40激动剂处理的scRNA-seq数据分析发现anti-CD40激动剂调节能够提高Ccl22+ cDC1细胞的频率，而其他的DC亚群在处理2天后或者降低或者未改变（图5F）。Anti-CD40抗体能够显著活化这些cDC1细胞，由CD80和CD86的表达衡量（图5G、5H）。此外，anti-CD40能够提高cDC1细胞产生IL-12（图5I），该细胞因子能够提高Th1发育以及CD8+ T细胞产生IFNg。由于anti-CD40抗体对TAMs的效果并不深远（图S7E），研究者在2天后观察到了Mafb+ TAMs的瞬时降低，并且在10天后显著降低（图S7E），这可能反应了CD40激动剂处理导致肿瘤相关免疫细胞频率的大范围改变。研究者经过scRNA-seq分析确定了Ccl22+ cDC1细胞作为主要的髓性细胞，在MC38模型中anti-CD40处理后激活。重要的是，活化的cDC1s的显著基因与CRC患者的整体存活相关（图5J），这也提示，anti-CD40能够激活这些细胞与肿瘤相关。
Anti-CD40处理能够提高效应器记忆CD8+T细胞并且引起肿瘤中Bhlhe40+ Th1样细胞的活化和扩增
研究者进一步探究了anti-CD40处理对肿瘤渗透T细胞的功能影响。从MC38肿瘤模型中分离得到的T细胞进行scRNA-seq（图S7F、S7G），结果显示某些CD4+和CD8+T细胞亚群受CD40激动剂处理的影响（图6A）。研究者进一步从scRNA-seq中捕获了TCR a-和b-链的序列（表S6A），利用之前开发的STARTRAC索引定义T细胞的克隆增殖、转移和发育。Anti-CD40处理能够显著提高肿瘤记忆CD8+T细胞亚群的比例，但是降低疲劳的CD8+T细胞亚群的频率特别是在10天处理后（图6B）。此外，anti-CD40处理能够显著改变表达图谱以及Lag3+ Tex和Mki67+ Tex亚群中疲劳标记物的动力学，伴随处理后Ctla4和Tigit的表达显著降低且10天后Pdcd1和Lag3的表达显著降低（图6C）。流式实验再次证实了scRNA-seq的结果，说明anti-CD40处理能够挺高效应CD8+T细胞，降低PD1+疲劳的CD8+T细胞（图6D-6G）。利用STARTRAC分析，研究者发现Ccl5+ Tem CD8+T细胞与其他CD8+T细胞相比具有较高的迁移指数（图S7H），这与之前的发现CD8+ Tem细胞比Trm或者疲劳的CD8+ T细胞更易迁移。的确，anti-CD40处理能够戏剧性的提高Ccl5+ Tem CD8+ T细胞的比例，而不是tdLNs中Cxcr6+ Trm群体（图S7I）。在Ccl5+ Tem亚群中进一步分离了TCR克隆表型发现，在anti-CD40处理后具有更高克隆扩增的细胞在肿瘤和tdLN中表现出更多的TCR(图6H、6I、S7J、表S6B)。此外，Ccl5+ Tem和Cxcr6+ Trm CD8+ T细胞之间的转换系数显著高于其他CD8+T细胞亚群对，提示肿瘤中某些Cxcr6+ Trm细胞可能从渗透的Ccl5+ Tem细胞中衍生而来，这一过程经anti-CD40处理后加强（图6J）。综上实验数据揭示了anti-CD40处理对扩增、转移、肿瘤渗透Tem和TrmCD8+T细胞的转换效果。
研究者同样发现CD40激动剂处理对肿瘤渗透CD4+T细胞亚群产生影响。尽管anti-CD40处理2天后能够显著扩增Treg细胞，Treg细胞在10天处理后降低（图7A）。STARTRAC-扩增系数证实anti-CD40处理2天后能够提高Treg的扩增，在10天后受到限制（图7B）。相反，anti-CD40处理2天和10天后能够特异性提高Bhlhe40+ Th1-样细胞的比例，这也证实anti-CD40能够激发这些细胞的克隆增殖（图7B）。有趣的是，研究者注意到anti-CD40处理能够显著降低Bhlhe40+ Th1-样细胞中Cd40lg的表达（图7C、7D），实验结果进一步由流式证实（图7E）。这些结果提示CD40激动剂可能提高肿瘤相关BHLHE40+ Th1-样细胞和cDC1细胞的交流。
之前的研究确定IFNG表达的BHLHE40+ Th1-样细胞在MSI CRC病人群体中富集，对ICB治疗应答。研究者确定从MC38分离得到的Bhlhe40+ CD4+ T细胞也能表达高水平的Bhlhe40（图S7K）且产生更多的IFNg(图7F、7G), 表达Ki67增殖的标记物，进一步诱导增殖（图7H）。因此肿瘤cDC1细胞中anti-CD40的活化能够导致IFNg产生的肿瘤渗透CD4+Th细胞频率升高。与这一假说抑制的是，体外研究发现anti-CD40处理能够提高DC细胞的成熟，在CD4+T细胞中用亚适浓度的抗原处理细胞进一步提高Bhlhe40的表达而非Tbx21。在人类CRC病人中表达IFNG的BHLHE40+ Th1-样细胞和cDC细胞进一步分析发现Th1样细胞的基因特征与成熟的和非成熟的cDC1细胞正相关。这些cDC1细胞也在MSI-H CRC病人中显著富集（图7J），提示在cDC1细胞和BHLHE40+ Th1-样细胞中存在相互作用。重要的是，研究发现anti-CD40能够提高Bhlhe40+ Th1-样细胞可能是CD40激动剂能够协同anti-PD1有效治疗的机制（图5A、5B）。
总结
研究者揭示了髓性T细胞和髓性基质细胞在CRC中的相互作用，为免疫治疗提供了分子基础，并通过单细胞测序技术为分离肿瘤相关免疫群体发挥的作用，研究的数据组为今后肿瘤渗透免疫细胞的进一步挖掘提供资源。
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