编译：夕夕，编辑：夏甘草、江舜尧。
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导读
黄羽毛在鸡中很常见，尤其是在中国本土惠阳的胡须鸡。作者对惠阳胡须鸡和白色来亨鸡杂交的F1，F2和F3的种群的羽毛颜色分布进行了研究，确定了其黄色羽毛性状的遗传特征和已知的金色羽毛和其他已知羽毛性状的遗传特征进行了区分。羽毛囊的显微镜分析表明，在黄色羽毛中存在黑色素颗粒，但在白色羽毛中不存在。为了筛选与黑色素颗粒形成相关的基因，作者对7周龄和11周龄的F3代鸡的黄色和白色羽毛囊进行转录组测序分析。当比较黄色和白色羽毛囊时，共鉴定到了27个差异表达基因（DEG）。这些DEG富集在于色素沉着过程的功能。使用qRT-PCR验证下调表达基因TYRP1，DCT，PMEL，MLANA和HPGDS。作者的结果提供了对鸡黄色羽毛的形成的理解。
原名：Transcriptome analysis of feather follicles reveals candidate genes and pathways associated with pheomelanin pigmentation in chickens
译名：鸡羽毛毛囊转录组分析揭示了鸡褐色素沉着的候选基因和途径
期刊：Scientific Reports
IF:3.998
发表时间：2020.8
通讯作者：张浩
通讯作者单位: 中国农业大学动物科学技术学院动物育种国家工程实验室
DOI号：10.1038/s41598-020-68931-1
惠阳胡须鸡（HB）原产于中国广东省，雌雄羽毛均为黄色(图1)。白色来亨鸡（WL）是纯合子的显性白色基因，有白色羽毛。雄性HB鸡与雌性WL鸡杂交繁殖的F1群(684只公鸡和685只母鸡)中，所有公鸡羽毛均为白色;母鸡的羽毛颜色分布为:白5%、灰5%、黄45%、灰羽黄45%。F2种群中公鸡和母鸡的羽毛颜色分布如下:白色(49%)、yel- low(28%)、灰色(12%)、黑色(1%)和黑白条纹(10%)。只选择F2的黄羽繁育者繁殖F3群体，其中白羽繁育者占37%。
HB鸡的羽毛均为黄色，具有白色显性基因型(ss)和白色显性基因型(ii);而WL鸡的羽毛均为白色显性基因型(ii)和白色显性基因型(S/W)。在F1代母鸡中，显性白色基因座为Ii型，银色基因座为s/W型。但F1代母鸡的黄羽个体比例较高，说明控制黄羽的基因对显性白色基因有上位效应。F1代母鸡出现多种羽毛颜色也表明，黄色羽毛基因可能受到其他羽毛颜色基因的影响。F1代公鸡显性白色基因座为Ii型，显性银色基因座为Ss型;F1代公鸡羽毛均为白色，说明银色基因对黄色羽毛基因有上位效应。有趣的是，作者在一些淡黄色羽毛的鸡身上发现了黄色背景上的白色条纹，类似于黑白条纹的图案，在这些个体中也发现了B等位基因的存在。这表明，当B等位基因和黄色等位基因同时存在时，就会出现黄色和白色条纹图案的羽毛。结果表明，黄羽基因对白色显性基因有上位性影响，而叶羽-低羽基因对银色显性基因有实体性影响。然后鉴定了F3种群中黄羽和白羽个体的白色和银色显性基因座。选取6只黄羽和6只白羽个体进行rna序列分析。它们在隐性白色基因座(CC)和银色基因座(s/W)是纯合的，显性白色基因座是纯合的(II)或杂合的(II)。说明黄羽鸡和白羽鸡的表型差异不是由这些基因位点引起的。黄色和白色羽毛囊的组织学切片显示，它们的细胞组成相似，有丰富的角质形成细胞和真皮细胞。然而，黄毛囊中存在黄褐色颗粒，而白色毛囊中不存在(图2)。由于黑色素是唯一一种能使羽毛呈黄色的原因，作者的初步结论是，黄色羽毛的颜色是由黑色素的增加引起的。
对12只鸡(3只7周大的白羽鸡，分别为7W1、7W2和7W3；3只7周龄鸡的黄色羽毛:7Y1、7Y3、7Y4；3只11周龄鸡的白色羽毛:1W1、1W3、1W4；和3只11周龄鸡的黄羽:1Y1、1Y3、1Y4)提取RNA并构建测序文库，共获得数据140.7G。对测序数据进行过滤并与参考基因组比对，比对效率在80%以上。共检测到表达基因10036-10070个，平均来说，52.68%的表达基因在羽毛囊中表达水平较低，1.65%的基因表达水平较高（FPKM≥500）。比较黄毛囊和白毛囊的基因表达水平，7周龄组共有177个差异表达基因，1 1周龄组共有163个差异表达基因（图3）。GO富集分析表明，7周龄的差异表达基因主要富集在黑素小体，溶酶体膜和早期核内体。KEGG富集分析表明，主要富集在黑素生成等途径。11周龄的差异表达基因的GO富集主要在黑素小体和质膜的组成成分（表1）。
在两个差异分组织组中都有27个共有的DEGs。这些显着丰富于与色素有关的两个GO类“黑素体”和“黑素-某些组织”。涉及的基因包括PMEL，TYRP1和MLANA（表1）。另一个共有的DEG，HPGDS，参与催化与谷胱甘肽的偶联反应，可能在苯丙氨酸甲酯合成中起重要作用。6. 关键色素基因表达模式及RNA-seq数据验证使用qRT-PCR对不同周龄的羽毛囊样本的5个关键色素基因TYRP1、DCT、PMEL、MLANA和HPGDS的表达水平。结果表明，在四个时间阶段，黄羽组的TYRP1和DCT表达均低于白羽组，差异均有统计学意义(P < 0.05)。PMEL、MLANA和HPGDS基因在5、7、11周龄鸡黄毛囊中的表达显著低于白色毛囊(P < 0.05)；然而，在3周龄的幼雏中，差异并不显著(图4)。这可能是因为幼雏在3周龄时还没有到脱毛的关键时刻。在5周龄、7周龄和11周龄黄羽毛样本中，TYRP1和DCT的表达水平约为白羽毛样本的10倍，提示这两个基因可能参与了鸡羽毛颜色的着色和控制。除上述5个关键色素基因外，作者选择1个DEG (MFSD12)和3个非DEG (TYR、NR1H4和THRSP)，利用qRT-PCR检测7周龄和11周龄鸡羽毛卵泡中的基因表达，验证RNA-seq分析结果。MFSD12在表达水平上有显著差异(P < 0.05)，而三种非degs无显著差异(图4)，说明RNA-seq分析结果是可靠的。
在鸟类中，羽毛颜色的变化是由于黑色素的产生、分布或沉积的改变，而羽毛毛囊是唯一产生羽毛黑色素的地方。在羽毛毛囊中，成熟的黑素细胞产生黑素小体来形成黑素;然后，新合成的黑色素被转移到羽毛的角质形成细胞中，赋予了羽毛独特的颜色。黑素体有两种类型，真黑色素小体和嗜黑色素小体。真黑色素小体是具有纤维基质的椭圆形实体，并负责真黑色素的合成。作者的羽毛卵泡的石蜡切片没有被充分放大以观察黑素小体的结构和确定类型。尽管如此，作者还是可以确定颜色所产生的黑色素的类型，并得出结论，黄色羽毛毛囊中黑色素的产生要比白色羽毛毛囊中要多，而不是真黑色素。在本研究中，我们发现显性白色基因座不抑制黑色素的合成和沉积。显性白色等位基因可使PMEL淀粉样蛋白的形成由功能性转变为致病性，并抑制真黑素合成。同样，先前的研究表明，PMEL的功能性突变并不影响银毛马、银突变小鼠、山鸟色斑纹家犬和黄羽日本鹌鹑的黑色素的产生。这些结果是可以理解的，因为PMEL编码的跨膜糖蛋白是真黑素小体纤维基质的主要成分，而不是嗜黑素小体的成分。PMEL沉默实验显示，包括TYR在内的黑色素生物合成基因的mRNA表达与对照组没有差异。这说明显性白色等位基因在蛋白水平上是有功能的，但在作者的研究中对黑色素生物合成基因的mRNA表达没有影响。黑色素的产生是由相关的酶及其代谢能力决定的。例如，TYR的存在可以使酪氨酸快速氧化为多巴喹酮，从而启动黑素细胞中的真黑素或黑色素合成途径。TYR基因的突变会导致黑色素产生的严重不足。鸡的隐性白色羽毛颜色是由TYR基因内含子4上的逆转录病毒序列插入引起的，导致含有58外显子的正常转录本的表达量显著减少。TYR、TYRP1和DCT的含量或活性也与真黑素有关，因为它们在真黑素合成的最后一步中起着重要作用。此外，产生的黑色素的类型直接取决于组织中巯基化合物的数量，如半胱氨酸和谷胱甘肽。因此，催化谷胱甘肽反应的酶的存在和活性，如谷胱甘肽过氧化物酶、谷胱甘肽还原酶和谷胱甘肽s -转移酶，将改变黑素形成的过程。TYRP1是酪氨酸酶基因家族中克隆的第一个色素基因，它编码酪氨酸酶相关蛋白1，这是一种公认的膜结合的含铜酶，在真黑素合成的最后一步中发挥关键作用。先前的研究已经证明，日本鹌鹑、鸡、猫、兔和牛的TYRP1功能变化与以黑色素为基础的被毛颜色之间存在很强的相关性。TYRP1的低表达水平与以黑色素为基础的毛色相关。造血前列腺素D2合成酶(HPGDS)是sigma类谷胱甘肽s-反式酶(GSTs)的一种。在巯基酸合成过程中，通过催化诱变剂和致癌物与谷胱甘肽的结合，HPGDS可以作为多种解毒反应的辅助因子。谷胱甘肽作为亲核试剂，是动物组织中含量最多的巯基化合物，主要存在于好氧生物的细胞质中。胱甘肽水平与黑色素沉积在脊椎动物的皮肤有关。高浓度的谷胱甘肽允许它与多巴喹酮结合形成5- s -胱氨酸多巴，从而启动黑色素合成途径。当谷胱甘肽浓度降低时，多巴喹酮直接转化为多巴酚罗马，最终形成真黑素。在黑色素瘤细胞中，低水平的谷胱甘肽被发现与真黑色素型色素沉着有关，而高水平的谷胱甘肽则与黑色素型色素沉着有关。对于黄羽和白羽的形成，作者推测，作者讨论的5个色素相关基因导致了黄羽中真黑素的减少和黑色素合成的增加。此外，由于显性白色基因座的存在，白色羽毛和黄色羽毛都缺乏正常的真黑素合成所需的真黑素小体。最后，在黄色羽毛样本中只检测到黑色素，而在白色羽毛样本中两种黑色素均未检测到。总之，通过对HB×WL鸡子代种群羽毛颜色分布的分析，揭示了黄羽基因的遗传规律。HB的黄色羽毛是由于羽毛毛囊中色素小体中色素黑素合成增加所致。通过转录组谱和qRT-PCR验证，TYRP1、DCT、PMEL、MLANA和HPGDS下调真黑素和黑色素含量，导致黄羽的形成。作者推测，黄色羽毛的表型特征可能是由这些基因的表达减少引起的。这些发现为今后对黄羽鸡的研究提供了新的见解。
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