微生物检验常见问题问答集锦（一）
应广大粉丝的需求，小编将陆续推出《微生物检验问答集锦》系列。本系列所列出的问题均是微生物检验过程中提问频次较高的问题，我们咨询专家老师后汇编，希望可以帮助微生物检验从业人员对检验过程中遇到的问题有新的理解。大家对感兴趣的、比较关注的问题，也可以后台留言，我们一起交流探讨！
问、灭菌锅化学检验和生物检验是每次实验都需要做吗？还是定期检验一下灭菌锅的性能呢？
答：化学法是每次都要做的，生物法可以定期做，根据灭菌锅的使用频率，每周、每半月或每月做一次即可。
问：沙氏葡萄糖琼脂培养基（SDA）上会不会生长细菌？
答：SDA不是选择性培养基，而是一种广谱的增菌培养基，pH范围5.4-5.8，某些细菌是可以在SDA上生长的，霉菌和酵母菌总数计数时SDA上生长的菌均应计入霉菌和酵母菌总数；或者可以经过评估选择含有抗生素（如氯霉素）的SDA或者玫瑰红钠琼脂培养基进行霉菌和酵母菌总数计数。
问：琼脂培养基为什么需要倒置培养？
答：在进行微生物培养时，若正置培养，琼脂培养基中的水分易蒸发使平板干裂，不利于微生物的生长；同时水蒸汽会在平皿盖上形成冷凝水，若回落在培养基表面，会使菌落蔓延生长，无法计数，若冷凝水太多会使培养基与平皿分离，容易滑动倒置培养可减少培养基表面的空气流动，减慢培养基中水分蒸发的速度，充分维持弹性，有利于菌株的生长和繁殖，防止空气中杂菌对培养基及培养物造成污染；也会由于重力作用在一定程度上使营养物质沉积到培养基表面，有利于微生物利用营养物质；倒置的平板方便拿取，避免环境中杂菌的污染。
需要注意的是，《食品安全国家标准 食品微生物学检验霉菌和酵母计数》（GB4789.15-2016）是要求正置培养，而非倒置，以防霉菌孢子形成次生菌落，影响计数结果。
问：食品企业的环境检测应该依据那个标准？
答：GB/T16294-2010《医药工业洁净室(区)悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法》都有规定，可以做为参考。
问：请问高压灭菌锅需要操作人员有压力容器操作证吗?有些人说属于《特种设备安全监察条例》需要操作证？
答：CNAS-CL 01-A001: 2018的 6.2.2.2条款里有说讲到，如实验室使用的高压蒸汽灭菌器不属于简单压力容器(定义参见TSG R0003 -2007《简单压力容器安全技术监察规程》)时，操作人员需持有特种作业人员证。
问：一些不常用的培养基开瓶后在效期内较长时间没有用完，那么这些开瓶后的培养基需要进行复验吗？
答：开瓶后的培养基，如果长时间不使用，还在效期内，建议开瓶后间隔1年进行复验。如果出现结块，则不能使用。同理，如果同一批次一次购买量较多，一年内未使用完，也建议进行复检。
问：控制菌检查法中用到的培养基，在做培养基适用性的时候，其中有“指示特性”的表述，那么“指示特性”是指的什么意思？
答：培养基指示特性包括菌落大小、形态特征、指示剂反应情况（菌落颜色变化）等。例如大肠埃希氏菌在麦康凯琼脂培养基上桃红色菌落有沉淀环、乙型副伤寒沙门菌在XLD有黑心等。
问：什么是不可接受微生物？
答：不可接受微生物通常是指那些已知有明显致病性的，存在足够的数量，通过产品的给药途径可能导致患者不可接受风险的微生物。如何确定一种微生物是不可接受的，需要进行风险分析，包括微生物负载量、微生物特性、产品特性、给药途径、对患者潜在影响等。
问： 培养基灭菌没有按照厂家提供的灭菌参数进行，是否可行？
答：可以。厂家产品说明书提供的灭菌参数可作为参考使用，使用单位也可以根据自己实验室的实际情况，在相关法规要求内，使用自己验证过的灭菌参数来执行。
【法规来源：中国药典2020版9203药品微生物实验室质量管理指导原则 ……培养基灭菌应按照生产商提供或使用者验证的参数进行……】
问：革兰氏染色有哪些注意事项？
答：（1）最好挑选18-24h的菌落进行革兰氏染色,培养时间过久的的革兰氏阳性细菌可能会被染成红色而造成假阴性。
（2）挑取适量的菌，不宜过多,均匀涂开。
（3乙醇脱色是革兰氏染色是否成功的关键,15-30s为宜，脱色不够可能会造成假阳性,脱色过度可能会造成假阴性。
问：如何根据实验需要制备斜面？
答：根据实验需求，摆放斜面一般有三种形式：
（1）长斜面：斜面底部刚覆盖试管底部，上部距管口2.5-3cm左右；例如TSA传代斜面。
（2）高层斜面：斜面与底层高度约为2:3，即底部高约3cm，斜面长度约2cm；如三糖铁高层斜面。
（3）普通斜面：斜面底部距试管底部约1cm，上部距管口约2.5-3cm。
问：三糖铁培养基颜色变化原理是什么？
答：该培养基含有乳糖、蔗糖和葡萄糖的比例为10:10:1，只能利用葡萄糖的细菌，分解葡萄糖产酸可使斜面先变黄，但因量少，生成的少量酸接触空气而氧化，加之细菌利用培养基中含氮物质，生成碱性产物，故使斜面后来又变红，底部由于是在厌氧状态下，酸类不被氧化，所以仍保持黄色。而发酵乳糖的细菌则产生大量的酸，使整个培养基呈现黄色。如菌种接至培养基培养后产生黑色沉淀，是因为某些细菌能分解含硫氨基酸，生成硫化氢，硫化氢和培养基中的铁盐反应，生成黑色的硫化亚铁沉淀。
问：如果三糖铁上斜面红色、底层黄色，中间有黑色且产气，能否判定为沙门菌？
答：不能。某些非沙门菌也能在三糖铁上呈现和沙门菌一样的颜色变化，例如奇异变形杆菌。如三糖铁上有上述颜色变化，需要进一步的进行适宜的鉴定试验，确证是否为沙门菌。
如果采用传统的生化鉴定，可参考GB 4789.4-2016中沙门氏菌检验的方法。